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DEPERIMENTI E GIALLUMI DI SPECIE ARBOREE ED ARBUSTIVE DI INTERESSE OFFICINALE.

Piante di eucalipto, ontano nero, olmo campestre, olivo, sambuco e mirto, sospette di infezioni fitoplasmatiche, verranno accuratamente monitorate in vari areali della Campania e della Basilicata. Per ciascuna delle suddette specie, un congruo numero di piante asintomatiche nonché di piante sicuramente sane tenute in serra a prova di insetti verrà incluso, nella presente ricerca, per confronto. La presenza di infezioni fitoplasmatiche nelle piante esaminate verrà accertata mediante la tecnica PCR usando sia primers universali che amplificano sequenze del 16S rDNA di tutti i fitoplasmi noti, sia primers specifici amplificanti frammenti del 16S rDNA di particolari gruppi di fitoplasmi o di singoli fitoplasmi. Gli ampliconi derivanti dall’uso di primers universali e/o gruppo-specifici verrano sottoposti ad analisi RFLP impiegando varie endonucleasi di restrizione e/o a sequenziamento. Al fine di aumentare la sensibilità della tecnica PCR, verranno svolti esperimenti di nested PCR nei quali il prodotto della prima amplificazione ovvero della PCR diretta, verrà impiegato in una successiva riamplificazione utilizzando primers interni a quelli usati nella prima amplificazione. E’ ben noto, infatti, che i fitoplasmi presenti nelle piante arboree, a causa della loro bassa concentrazione e della loro irregolare distribuzione, spesso, sono difficili da diagnosticare. Inoltre, nel caso di infezioni multiple, molto spesso solo uno dei fitoplasmi presenti è prevalente e, pertanto, diagnosticabile mediante la PCR diretta mentre gli altri sono presenti in concentrazione molto bassa da essere diagnosticabili soltanto tramite la nested PCR. Tutte le piante malate rinvenute verranno tenute sotto osservazione per l’intera durata del progetto di ricerca al fine di valutare nel tempo le loro reazioni alle infezioni fitoplasmatiche. Una scala di gravità dei sintomi ed una descrizione dettagliata degli stessi verranno di conseguenza elaborate e confrontate con quelle disponibili in letteratura relative ad altre aree geografiche e/o ad altre combinazioni pianta ospite/fitoplasma. Il ruolo patogenetico di tutti i fitoplasmi identificati verrà valutato a mezzo di esperimenti di inoculazione mediante innesto nei quali porzioni di piante malate verranno innestate su piante sane della stessa specie e, tenendo poi, le piante innestate sotto osservazione fino alla comparsa dei sintomi. I fitoplasmi, essendo organismi non coltivabili su substrati artificiali, sono particolarmente difficili da studiare. Pertanto, non essendo possibile per essi soddisfare i postulati di Koch, la loro trasmissione a piante sane della stessa specie in cui sono stati rinvenuti, accompagnata dalla comparsa di sintomi, costituisce una prova fondamentale del loro coinvolgimento nel determinismo di una data malattia. La variabilità dell’espressione sintomatologica in ciascuna delle popolazioni di piante malate di eucalipto, ontano nero e olmo campestre verrà studiata sia attraverso l’identificazione di fitoplasmi geneticamente differenti, come sopra riportato, che attraverso l’individuazione nell’ambito di uno stesso fitoplasma, di ceppi che sia pure indistinguibili a livello del 16S rDNA, differiscono per vari altri aspetti quali virulenza, aggressività, tipo di sintomi indotti, specificità per l’insetto vettore, gamma di piante ospiti, concentrazione nei tessuti dell’ospite, distribuzione geografica, ecc. Ceppi differenti in uno stesso fitoplasma verranno individuati mediante analisi RFLP e di sequenze nucleotidiche di geni che sia pure conservati nei procarioti, presentano una maggiore variabilità rispetto al 16S rDNA. Questi includono i geni rplV (rpl22) e rpsC (rps3) (i quali codificano rispettivamente le proteine ribosomiali L22 e S3), tuf (che codifica il cofattore Tu =EF-Tu), vmp1 (codificante una proteina di membrana che regola l’interazione fitoplasma-pianta ospite e/o fitoplasma-insetto vettore) e secY (che codifica componenti del sistema di traslocazione sec).