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SISTEMA ENDOCANNABINOIDE E PATHWAY DEL MEVALONATO NELLA PROGRESSIONE NEOPLASTICA E NELLA RISPOSTA IMMUNE ANTITUMORALE

Il progetto rappresenta uno studio avanzato degli effetti svolti da composti del sistema endocannabinoide e da derivati isopenteniladenosinici nella progressione neoplastica e nella risposta immune antitumorale. I risultati ottenuti in vitro, per entrambi i gruppi di molecole, consentono nella successiva fase di studio di traslare i dati in modelli animali preclinici ed in tumori primari umani. Nella prima parte dello studio, saranno esaminate neoplasie ottenute da pazienti, affetti da glioblastoma multiforme a diverso grado, sottoposti a resezione chirurgica presso il Servizio di Neurochirurgia (dir. Prof. Catapano) dell'Ospedale "G. Rummo" di Benevento. I carcinomi mammari, colonrettali ed i melanomi saranno collezionati dal prof. P. Zeppa e dalla dott.ssa A.M. Cascone presso il Servizio di Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera Universitaria S. Giovanni di Dio e Ruggi D'Aragona di Salerno. Nei tessuti tumorali sarà studiata l'espressione dei recettori cannabinoidi e la loro correlazione a indici prognostici, marcatori di grading e fattori di progressione, mediante IHC, analisi di Western blot, real-time PCR. Quando possibile, dal tumore primario a fresco, si procederà all'allestimento di colture primarie nelle quali verranno valutati il tasso proliferativo, l'espressione di fattori neoangiogenetici e di metastatizzazione, indici di transizione epitelio-mesenchimale e di staminalità, in seguito al trattamento con EC, con i6A o con il solo veicolo. Gli esperimenti saranno condotti mediante citometria a flusso ed analisi di Immunofluorescenza. Dati sperimentali ottenuti ed ancora in fase di completamento, evidenziano la capacità dell'i6A e dei suoi analoghi di esercitare un significativo effetto antitumorale in vitro, innescando modulazioni epigenetiche e regolando la trascrizione di diversi geni bersaglio. In questa fase del lavoro l’effetto antitumorale sarà testato in vivo in topi atimici SCID, femmine di 6-8 settimane, sottoposti ad inoculo s.c. di cellule di glioblastoma (U87, U251 o U343MG), carcinoma del colon (HCT116, DLD1 o SW620) o carcinoma mammario (MDA-MB-231). Quattro-sette giorni dopo l’inoculo gli animali saranno trattati con i6A, con suoi analoghi o con il solo veicolo, somministrati per via s.c. peritumorale o per via i.p. Le dimensioni del tumore primario saranno valutate settimanalmente; i lisati cellulari ottenuti dalle neoplasie escisse saranno testati mediante Proteome Profiler Antibody Arrays (R&D System) per l'analisi del proteoma ed utilizzate per valutare modificazioni epigenetiche (mediante Abcam EpiSeeker technology). Quando possibile, i risultati suggeriti dal modello animale saranno confermati nelle linee primarie descritte trattate con composti selezionati dai risultati ottenuti nelle fasi precedenti dello studio. Basse concentrazioni di i6A aumentano la risposta immune NK-mediata diretta contro cellule tumorali bersaglio. Dosi elevate (≥10uM) sembrano invece svolgere un effetto prevalentemente inibitorio della citotossicità NK verso cellule K562, riducendo l'espressione di specifici recettori (NKp44 e NKG2D) e la secrezione di citochine (RANTES, MIP-1α, TNF-α, IFN-γ). Tuttavia, i6A svolge un buon effetto anti-angiogenetico in vitro in cellule HUVEC attivando AMP-chinasi. Nell'ultima fase del progetto si valuteranno, in vitro ed in vivo, gli effetti di alte e basse dosi di i6A e di EC studiando l'espressione di ligandi di attivazione NK (MICA/B, ULBP1-4, MHC-I) in linee cellulari (U251, U87, HCT116) trattate con i composto oggetto dello studio. Mediante co-coltura delle NK con il target specifico, testeremo l'effettiva efficacia della modulazione di tali ligandi nell'attivazione di citotossicità specifica e nella secrezione di citochine quali IFNγ. Nei tumori escissi dai modelli animali descritti verranno valutati marcatori di neoangiogenesi, ligandi di attivazione NK e l'eventuale infiltrazione peritumorale di linfociti a selettiva attività citotossica.