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PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE: IL FATTORE DI CRESCITA NEURONALE, FENOMENI DI TOSSICITÀ LEGATI ALLA CRESCITA DELL¿OSPITE, OTTIMIZZAZIONE DEL BIOPROCESSO

Il lavoro di ricerca nel laboratorio di Biotecnologia e Microbiologia Industriale del DIIn dell’Università di Salerno parte come menzionato precedentemente, da una base consolidata data la disponibilità di un in sistema di espressione idoneo che facilita la secrezione della proteina eterologa In questo caso, però, essendo la proteina eterologa una proteina umana sarà necessario eliminare i tratti corrispondenti alla Pir4 tramite la proteolisi sito diretta in vitro del prodotto proteico.Il ceppo industriale Y306 auxotrofo per il triptofano sarò usato come ospite e una volta trasformato sarà saggiato in batch e in fed-batch ottimizzando il processo sia attraverso lo studio dei fenomeni di tossicità che cercando il valore appropriato di portata volumetrica in modo da massimizzare sia la resa in biomassa che la produttività volumetrica., il lavoro sperimentale consisterà nell'allestimento di numerose prove in fermentatore fed-batch aerato si studierà la cinetica di crescita e quella di morte, gli indicatori di stress ossidativo quali catalasi e ROS (Reactive Oxygen Species) e si procederà alla determinazione delle concentrazioni del glucosio residuo e dell'etanolo eventualmente prodotto. Si avvierà poi un'analisi NMR sulle altre componenti chimiche presenti nei brodi capaci di influenzare la crescita microbica. Le prove in fed-batch saranno condotte in un fermentatore Biostat-Q plus provvisto di Unità per il controllo individuale di tre vessels. Il Biostat-Q plus è una nuova acquisizione del laboratorio T5b, resa possibile con i fondi del PON 2011 che consentirà di abbreviare i tempi di realizzazione del progetto, permettendo di effettuare tre prove di fermentazione in parallelo. La velocità di crescita della popolazione microbica sarà controllata attraverso il profilo di alimentazione e fatta variare in un range di valori tali da non superare la soglia critica, che determina lo shift tra metabolismo ossidativo e quello fermentativo. La coltivazione condotta in condizioni di alimentazione controllata avverrà dopo una fase batch atta a produrre un quantitativo di biomassa, ovvero un inoculo idoneo per l'avvio della successiva fase fed. Gli esperimenti a diverse velocità di alimentazione saranno utili anche per selezionare le migliori condizioni di produttività della proteina ricombinante. In parallelo alle prove sperimentali verrà sviluppato un modello matematico basato sui principi della System Dynamics, capace di simulare la crescita in presenza di fenomeni di inibizione tenendo presente i principali processi fisiologico-funzionali del lievito in crescita su terreni contenenti glucosio (uptake, catabolismo fermentativo e respiratorio, etc). Tali processi, descritti come flussi, saranno assemblati in un ambiente di modellazione flessibile e modulare. I risultati della sperimentazione e della modellazione consentiranno da una parte l'ottimizzazione del bioprocesso con la stesura di protocolli sperimentali e, dall'altra, la formulazione di nuove ipotesi sulle dinamiche di crescita cellulare