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ANALISI DEL FOSFOPROTEOMA DI CELLULE EPITELIALI INTESTINALI STIMOLATE CON MOLECOLE RILEVANTI PER LA MALATTIA CELIACA

Con il presente progetto intendiamo approfondire le conoscenze relative all'azione dei peptidi tossici della gliadina sulle cellule intestinali umane. Focalizzeremo l'attenzione sul peptide 31-43 dell'alfa-gliadina (p31-43), che rappresenta il prototipo dei peptidi tossici conosciuti, e impiegheremo, come peptidi di controllo, il peptide immunogenico 57-68 dell'alfa-gliadina, e altri peptidi non correlati, disponibili nel nostro laboratorio. Il modello di studio sarà rappresentato dalle cellule Caco-2, cellule di adenocarcinoma umano, spesso impiegate per studi sulla fisiologia dell'epitelio intestinale e, recentemente, come modello in vitro per gli studi relativi alla malattia celiaca.Gli approcci che seguiremo nel corso della ricerca saranno diversi, e di seguito descritti:1) Dal momento che la TG2 può partecipare all'attivazione di markers di infiammazione, tra cui Nf-kB (Eckert et al. Physiol Rev 2014), e che il p31-43 è in grado di attivare la TG2 (Caputo et al Plos One 2012), cercheremo, da un lato di dimostrare che tale peptide sia in grado di provocare l'attivazione di Nf-kB, e dall'altro che tale eventuale attivazione sia mediata dalla TG2. Monitoreremo l'attivazione di Nf-kB, del suo inibitore IkB-alfa, e delle chinasi coinvolte nel pathway, attraverso analisi di western blot utilizzando anticorpi contro le forme fosforilate di ciascuna proteina. Per valutare il coinvolgimento dell'attività catalitica della TG2, impiegheremo specifici inibitori commercialmente disponibili.2) In relazione al nostro recente studio in cui abbiamo analizzato le variazioni del fosfoproteoma in cellule Caco-2 stimolate con anticorpi anti-TG2 (Paolella et al Plos One 2013), ci proponiamo di valutare se le fosfoproteine già indicate nel suddetto studio, possano essere differenzialmente fosforilate anche in seguito al trattamento con il p31-43. I risultati che verranno ottenuti in tale direzione potrebbero contribuire a delineare le similitudini nell'azione degli anti-TG2 e dei peptidi della gliadina e a comprendere come questi due "attori" importanti per la celiachia, possano contribuire insieme alla patogenesi della malattia. Per questo studio impiegheremo i sistemi già settati di elettroforesi bidimensionale, seguita da analisi di western blot, per valutare gli spostamenti degli spot a seguito della variazione del pI della proteina in esame, a causa della fosforilazione differenziale.3) L'ultimo approccio prevede di effettuare analisi sull'intero fosfoproteoma di cellule trattate con il p31-43, così da evidenziare tutte le fosfoproteine modificate in seguito al trattamento. A tale scopo sarà opportuno eseguire una parziale purificazione delle fosfoproteine attraverso resine di affinità, prima di visualizzare il profilo proteico in elettroforesi bidimensionale. L'analisi degli spots, mediante apposito software, permetterà di individuare quelli significativamente diversi nel campione trattato e nel campione di controllo. Successivamente, si valuterà la possibilità di analizzare tali spots allo scopo di identificare le fosfoproteine in essi contenute. L'identificazione potrà vedere l'impiego di tecniche di spettrometria di massa e/o l'uso di specifici anticorpi.