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BIOLOGIA SINTETICA PER LA PRODUZIONE DI DITERPENI BIOATTIVI DI SALVIA SCLAREA

L'ottimizzazione della biosintesi di metaboliti secondari bioattivi mediante strategie di ingegneria metabolica, associata alla messa a punto di sistemi di colture cellulari e di tessuti su larga scala, garantisce una biomassa per l'estrazione e purificazione di molecole vegetali bioattive costante nel tempo equalitativamente uniforme, caratteristiche prioritarie per una loro applicazione a livello industriale. Il principale obiettivo del presente progetto è ottimizzare la piattaforma di produzione per l'estrazione e purificazione di diterpeni abietanici di S.sclarea, in particolare di etiopinone, che ha mostrato un'interessante attività antiproliferativa contro cellule di melanoma (Vaccaro et al. 2014). In particolare, saranno sovraespressi in radici avventizie di S. sclarea, i geni SynDXS e Syn DXR di Synechocystis per spingere il flusso metabolico verso una maggiore sintesi di diterpeni abietanici . Questo obiettivo sarà raggiunto mediante: 1) amplificazione e sequenziamento delle sequenze codificanti i geni DXS e DXR da DNA genomico di Synechocystis sp PCC6803; 2) costruzione di vettori binari di espressione in pianta (PKYLX71:35S2), in cui ai geni SynDXS e SynDXR sarà aggiunta al N-terminus la sequenza di transito della subunità piccola della RuBP carbossilasi (rbcs), per indirizzarli al cloroplasto, e clonati a valle del promotore forte costitutivo CamV 35S2; 3) trasformazione e ottenimento di linee indipendenti di radici avventizie di S. sclarea, secondo il protocollo riportato in Vaccaro et al, 2014; 4) selezione di linee di radici avventizie di S. sclarea con alti livelli di espressione dei trascritti e delle proteine DXS e DXR batterichei, mediante analisi qRT-PCR e western blot; 5) analisi quali-quantitativa del contenuto dei principali diterpeni abietanici in radici avventizie trasformate geneticamente, mediante analisi HPLC-DAD e confronto con composti standard purificati. Pubblicazioni 2n+1 Fasano R, Gonzalez N, Tosco A, Dal Piaz F, Docimo T, Serrano R, Grillo S, Leone A, Inze D (2014). Role of Arabidopsis UV RESISTANCE LOCUS 8 in Plant Growth Reduction under Osmotic Stress and Low Levels of UV-B. MOLECULAR PLANT. Vol. 7. Pag.773-791 Vaccaro MC, Malafronte N, Alfieri ME, De Tommasi N, Leone A (2014). Enhanced biosynthesis of bioactive abietane diterpenes by overexpressing AtDXS or AtDXR genes in Salvia sclarea hairy roots. PLANT CELL TISSUE AND ORGAN CULTURE. Vol. 119. Pag.65-77 Vassallo A, Vaccaro MC, De Tommasi N, Dal Piaz F, Leone A (2013). Identification of the plant compound geraniin as a novel Hsp90 inhibitor. PLOS ONE. Vol. 8. Pag.e74266-e74266 I