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REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE DELL'ESPRESSIONE DEL RECETTORE DELL'UROCHINASI

Sarà effettuato un miRNAseq sulla linea cellulare di AML KG1 (FAB M0-M1), scarsamente differenziata, che presenta bassi livelli di espressione di uPAR. Saranno selezionati miR potenzialmente in grado di bersagliare l’uPAR in base a predizione in silico e/o a dati presenti in letteratura. Tali miR verranno iper-espressi in cellule esprimenti uPAR; le cellule verranno poi lisate e analizzate per Western blot con anticorpi anti-uPAR, al fine di esaminare la reale capacità dei miR selezionati di regolare l’espressione del recettore. Sarà poi verificato che i miR in grado di regolare l’espressione di uPAR bersaglino direttamente il suo mRNA, utilizzando il vettore di espressione pGL3, nel quale è stata inserita, immediatamente a valle del gene reporter firefly-luciferasi, la 3’UTR dell’mRNA dell’uPAR; tale costrutto è già disponibile nel nostro laboratorio. Cellule ospiti saranno quindi co-trasfettate con il costrutto 3’UTR-pGL3, con i miR da convalidare o con un miR controllo, e con un costrutto contenente un gene controllo per la normalizzazione (Renilla luciferasi). Tali cellule saranno lisate e sottoposte a saggi di luciferasi utilizzando un luminometro. Specifici inibitori (LNA-ON) dei miR convalidati saranno inoltre trasfettati in linee cellulari di AML, per verificare se tali miR contribuiscano effettivamente alla regolazione post-trascrizionale dell’uPAR in cellule di AML. A tal fine i lisati delle cellule trasfettate saranno analizzati per Western blot con anticorpi specifici. Le cellule trasfettate con i miR convalidati o con i loro inibitori saranno inoltre sottoposte a saggi funzionali, in particolare saggi di migrazione in camera di Boyden, saggi di proliferazione con MTT, saggi di adesione e saggi di sopravvivenza, per verificare il loro effetto su funzioni cellulari nelle quali l’uPAR è coinvolto. Infine, l’espressione dei miR convalidati sarà analizzata in blasti purificati da pazienti affetti da AML. L’insieme dei risultatipermetterà di individuare nuovi miR che bersaglino uPAR in AML e che potrebbero contribuire a strategie terapeutiche anti-tumorali.