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STUDIO DELLA DIVERSITÀ GENETICA ED EPIGENETICA DEL GENERE PHRAGMITES.

Il progetto sarà articolato in più fasi volte a: 1. geo-localizzazione delle piante di Phragmites. Saranno individuate le piante distribuite nella regione Sardegna e nell’areale continentale italiano, e si procederà all’acquisizione delle coordinate geografiche, che saranno importate in un sistema informativo geografico. 2. campionamento e conservazione in gel di silice delle foglie delle piante geo-referenziate. Saranno prelevate foglie giovani delle piante precedentemente georeferenziate, e quindi conservate per le successive analisi. 3. estrazione del DNA genomico. Dalle foglie conservate sarà estratto il DNA genomico, mediante metodiche convenzionali, e sarà valutata la qualità e la quantità degli acidi nucleici estratti, mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio e analisi spettrofotometrica. 4. analisi genetiche mediante un pannello di marcatori molecolari (SSR, Simple Sequence Repeat) che siano altamente risolutivi nel discriminare le accessioni e che permettano anche di individuare polimorfismi allelici. Un’accurata ricerca bibliografica sarà necessaria allo scopo di individuare primers oligonucleotidici in grado di amplificare in PCR differenti loci microsatelliti delle varietà ed ecotipi oggetto di studio. La scelta delle coppie di primers oligonucleotidici da utilizzare successivamente sarà effettuata sulla base del livello di polimorfismo di ogni singolo locus SSR. Su un limitato numero di DNA sarà eseguita un’analisi preliminare per mettere a punto le condizioni di amplificazione ottimali, che forniscano profili elettroforetici stabili e riproducibili. Definite le condizioni di amplificazione in PCR, l’analisi molecolare sarà estesa a tutti campioni di DNA oggetto di studio, in aggiunta a campioni ottenuti da enti di ricerca italiani ed europei. I prodotti di PCR ottenuti dall’amplificazione dei vari loci saranno separati elettroforeticamente per la determinazione dell’esatto peso molecolare, mediante corsa su sequenziatore automatico capillare. I dati molecolari saranno analizzati ed elaborati mediante software dedicati allo studio della biodiversità genetica (GenAlEx, PowerMarker). In particolare, per caratterizzare il livello di polimorfismo genetico esistente tra le varietà di ulivo, sui dati molecolari saranno calcolati gli indici più comunemente utilizzati per questo tipo di indagine molecolare: eterozigosità osservata (Ho); eterozigosità attesa (He); Polymorphism Index Content (PIC); coefficiente di inbreeding (f). Sarà inoltre condotta un’analisi statistica mediante software Structure allo scopo di stimare il grado di variabilità genetica nel set di campioni analizzati. 5.analisi epigenetica mediante MSAP permetterà di valutare il grado di metilazione del DNA dei campioni di Phragmites indagati. La metodica MSAP consente di analizzare i polimorfismi dovuti alla metilazione a livello della citosina presente nella sequenza del DNA, mediante l’impiego di due enzimi di restrizione isoschizomeri, quali MspI e HpaII che, seppur riconoscendo la stessa sequenza nucleotidica, differiscono in termini di sensibilità alla metilazione. I dati molecolari saranno analizzati ed elaborati mediante software dedicati (MSAP, Structure, etc.).