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RUOLO DELL¿INFIAMMAZIONE SULLA SOPRAVVIVENZA E DIFFERENZIAMENTO NEURONALE

Le osservazioni sopra esposte sottolineano che la fine regolazione del processo infiammatorio a livello del SNC sia cruciale per la normale funzionalità dello stesso ed una inappropriata e prolungata risposta infiammatoria possa contribuire al progredire delle malattie neurodegenerative. Allo stato, non esistono dati conclusivi né per quanto riguarda la caratterizzazione dei processi infiammatori a livello della glia né per quanto riguarda le alterazioni dei neuroni conseguenti all’iperattivazione delle cellule della microglia e degli astrociti. Il presente progetto si propone di:1. Valutare l’espressione e l’attivazione dei principali effettori delle vie di segnalazione implicate nella risposta infiammatoria.Verranno utilizzate linee cellulari di microglia stimolate con fattori pro-infiammatori capaci di attivare i recettori TLR e sarà indagato il grado di attività dei pathways di NFkB, MAPK/ERK e JAK/STAT e delle principali proteine che ne regolano l’attivazione/inibizione. Si procederà inoltre, a determinare la produzione di citochine pro-infiammatorie quali TNFα, IL-1β e IL-6 e di chemochine quali IL-8 e MCP-1, una proteina in grado di indurre la chemotassi degli astrociti. Analoghi esperimenti verranno condotti su astrociti coltivati in presenza di mezzo condizionato da cellule microgliali o in presenza di specifici mediatori infiammatori. I risultati verranno confrontati con quelli ottenuti in altri tipi cellulari non appartenenti al sistema nervoso al fine di valutare specifiche differenze. Infine, poiché a livello periferico sono stati identificati alcuni meccanismi di feedback negativo che includono l’attivazione delle proteine SOCS e la produzione di mediatori antinfiammatori quali IL-10 e TGFβ che possono stimolare l’apoptosi, si procederà a verificare la possibilità che questi fattori possano indurre morte in linee cellulari neuronali e in neuroni primari.2. Valutare gli effetti dell’attivazione della microglia e degli astrociti sulla sopravvivenza neuronale.Recenti studi suggeriscono che i recettori TLR siano in grado di indurre sia apoptosi che necroptosi ma i meccanismi alla base di questa “scelta” all’interno delle cellule del SNC non sono noti. È stato riportato che la fase iniziale della necroptosi richiede l’interazione e la fosforilazione dei recettori TLR interagenti con la proteina chinasi1 (RIPK-1) e RIPK-3, si procederà, pertanto, a trattare cellule neuronali con IL-10 o TGFβ oppure con mezzo condizionato di microglia e/o di astrociti attivati da fattori pro-infiammatori e si valuterà l’induzione di apoptosi e/o necroptosi utilizzando la citofluorimetria a flusso e analizzando l’attivazione delle proteine specifiche di ciascun processo. In presenza di necroptosi, si procederà a valutare l’espressione e la distribuzione sub-cellulare di RIPK1 e RIPK3 e si analizzerà il grado di attivazione dei fattori a valle di tali enzimi come la proteina MLKL.3. Valutare gli effetti dell’attivazione della microglia e degli astrociti sul differenziamento neuronale.Diverse evidenze suggeriscono che i mediatori dell’infiammazione, quali specie reattive dell’ossigeno, TNFα e IL-1β prodotti da microglia e astrociti potrebbero interferire con lo sviluppo e la funzionalità dei neuroni. Si prevede pertanto di studiare i cambiamenti morfologici dei neuroni differenziati e non in seguito a utilizzo di mezzo condizionato di astrociti stimolati con TNFα e IL-1β o microglia stimolata con LPS. In particolare, verranno utilizzate cellule PC12 indotte a differenziare mediante il fattore di crescita dei nervi (NGF) e si procederà a valutare i cambiamenti morfologici mediante microscopia ottica ed elettronica. Inoltre, si analizzerà, mediante immunocitochimica e western blot, l’espressione e la distribuzione di specifiche proteine (Rac1, STAT3, tau ecc.) coinvolte nel rimaneggiamento del citoscheletro e formazione delle spine dendritiche e dell’assone.