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NUOVI PARAMETRI MOLECOLARI PREDITTIVI DI RIPOSTA AI FARMACI A BERSAGLIO MOLECOLARE SPECIFICO NELLE NEOPLASIE DEL COLON-RETTO.

Casistica: pazienti affetti da neoplasia del colon-retto in fase metastatica e trattati con chemioterapia/bevacizumab (I linea) (circa 90 pazienti in Data Base dedicato. Campioni di tessuto: estrazione dell'RNA dalle inclusioni in paraffina del tumore primitivo e dal plasma fresco congelato prelevato alla diagnosi (miRNA circolanti rilasciati dal tumore). Inoltre, sui campioni tumorali sarà valutata (IHC)l'espressione di: AC-9, VEGF, EGFR, Ki67 e HIF1. Estrazione dell’RNA totale secondo metodiche standard (Ambion mirVana RNA Isolation Kit-Applied Byosistems). I tessuti conservati in inclusioni in paraffina saranno tagliati ini fettine da 10 micrometri di spessore con microdissezioni eseguite per separare tessuto tumorale dallo stroma circostante dal tessuto sano adiacente e sparaffinati mediante passaggi successivi in xilene ed etanolo. La concentrazione dell’RNA totale estratto sarà misurata mediante lo spettrofotometro NanoDrop Technologies) e la sua qualità valutata mediante apposito saggio (Agilent Bioanalyzer, Agilent Technologies). Dopo avere analizzato l’RNA estratto, verrà determinato il cosiddetto RIN (RNA Integrity Number o valutazione quantitativa dell’integrità dell’RNA; valore soglia RIN > 5). Per i miRNA presenti nel sangue circolante, verranno analizzati i campioni di plasma EDTA (5 ml totali). L'estrazione di RNA verrà effettuata a partire da 0.5 millilitri di plasma utilizzando una procedura con TRIZOL, modificata rispetto a quella standard (concentrazione RNA soglia:>10 ng/microlitro. Un miRNA esogeno, quale il mir39 prodotto da C. Elegans, verrà utilizzato per la normalizzazione dell' estrazione di RNA. I livelli di espressione dei MiRNA saranno valutati con tecnologia microarray(miRNA Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hybriditazion Kit, Agilent Technologies).I segnali di fluorescenza sono rilevati mediante lo scanner DNA microarray G2505B (Agilent Technologies), e le immagini analizzate con apposito programma (Agilent feature extraction software, v9.5.3.1), utilizzando il GeneSpring GX 7.3.1 software (Agilent Technologies).Validazione dei livelli di MiRNA mediante real-time qPCR. I livelli di espressione dei MiRNA saranno successivamente validati mediante real-time PCR quantitativa, utilizzando il TaqMan® microRNA assay (Applied Biosystems).Tutte le reazioni saranno eseguite in 3 copie. L’espressione dei MiRNA sarà rilevata mediante il Chromo 4 detector (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Analisi Statistica. Procederemo alla identificazione del miglior cut-off per espressione di AC-9 attraverso l’analisi delle curve di ROC (receiving-operating characteristic) (Hanley JA; DeLong ER). La correlazione fra l'espressione delle diverse proteine studiate e la risposta ai trattamenti verrà valutata mediante il test del Chi-quadro (Greenwood PE) e sarà considerata statisticamente significativa una p minore o uguale a 0.05 risultante dal test esatto di Fisher. L’associazione fra l’espressione dei miRNA e la risposta sarà valutata mediante l’analisi di regressione logistica ed espresso come “odds ratio” di ottenere una risposta al trattamento e corrispondenti intervalli di confidenza al 95% (Breslow NE, 1980). Il tempo libero da progressione sarà valutato mediante il metodo di Kaplan Meier e la differenza stimata mediante il log-rank test (Peto R) e una p minore o uguale a 0.05 sarà considerata statisticamente significativa.Tutte le analisi statistiche saranno eseguite utilizzando il software SPSS versione 18.