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RUOLO DEL RECETTORE AD ALTA AFFINITA' PER LA LAMININA (67LR) IN CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE NORMALI E LEUCEMICHE: STUDIO DI NUOVI INIBITORI

Scopo del progetto è lo studio del ruolo del 67LR nel “trafficking” di CSE normali e leucemiche. Saranno studiati gli effetti dell’attivazione del 67LR su adesione, migrazione, proliferazione e sopravivenza di CSE normali e leucemiche. Si procederà inoltre all’identificazione delle vie di segnale intracellulare attivate dal 67LR e alla valutazione della capacità del 67LR di modulare l’attività di recettori integrinici e di recettori di chemotassi, in particolare di CXCR4, che svolge un ruolo chiave nella mobilizzazione di CSE normali e leucemiche. Data la sua aumentata espresione in cellule di LMA, saranno poi identificate mediante “virtual screening” piccole molecole organiche solubili in grado di inibire il legame del 67LR alla LM e i suoi effetti sulla diffusione e crescita leucemica.Il progetto sarà così articolato:FASE 1: analisi degli effetti del 67LR sulle interazioni delle CSE con lo stroma midollare mediante colture a lungo termine (LTC).Gli effetti del legame del 67LR alla LM sulle interazioni delle CSE con lo stroma midollare saranno analizzate in colture a lungo termine di CSE CD34+. Le colture a lungo termine (LTC) rappresentano il miglior modello in vitro dell’emopoiesi in vivo, infatti le CSE possono interagire con cellule stromali irradiate, riproducenti il microambiente midollare, e quindi organizzarsi in nicchie di attività emopoietica. Saranno valutati gli effetti di anticorpi anti-67LR sulla capacità di CSE CD34+ normali da midollo osseo (MO) e CSE mobilizzate con G-CSF di attecchire e di proliferare all’interno di uno stroma midollare e quindi di generare cellule inizianti colonie in colture a lungo termine (LTC-IC).FASE 2: analisi degli effetti del 67LR su adesione, migrazione, proliferazione e sopravvivenza di CSE.CSE CD34+ normali da MO, CSE mobilizzate con G-CSF, cellule CD34+ della linea di LMA KG1 e cellule primarie derivate da soggetti affetti da AML saranno sottoposte a saggi di adesione a LM, a saggi di migrazione verso LM in camere di Boyden, a saggi di proliferazione su LM (mediante MTT e incorporazione di 3H-timidina) e a saggi di apoptosi dopo adesione a LM (mediante citometria a flusso dopo marcatura con ioduro di propidio e Western blot con anticorpi anti-caspasi 3). Il ruolo del 67LR e il suo cross-talk con i recettori integrinici specifici per la LM e con CXCR4 sarà studiato mediante preincubazione con anticorpi specifici. Fase 3: analisi delle vie di trasduzione del segnale attivate dal legame del 67LR alla LM in CSE.CSE CD34+ da MO e mobilizzate con G-CSF, cellule CD34+ della linea KG1 e cellule primarie di AML saranno piastrate su LM a vari tempi. Le cellule saranno lisate e analizzate mediante Western blot con anticorpi fosfo-specifici diretti contro i possibili mediatori del segnale intracellulare. Fase 4: identificazione mediante virtual screening di piccole molecole in grado di inibire il legame del 67LR alla LM e i suoi effetti. Il disegno di farmaci basati sulla struttura dei bersagli è considerato un passo cruciale nello sviluppo di terapeutici. Lo screening computazionale di database di molecole dirette contro la struttura tridimensionale di una proteina può fornire una rapida e accurata previsione delle modalità e affinità di legame di possibili molecole per l’ottimizzazione di composti guida. Il Virtual Screening Basato sulla Struttura (SBVS), che include tecniche di “docking molecolare” ad alto rendimento, è un modo di esplorare i domini di legame di una proteina e di fare delle predizioni sul legame a ligandi specifici. Abbiamo condotto un SBVS (in collaborazione con il Prof. A. Lavecchia, Dipartimento di Farmacia, Università “Federico II”, Napoli, Italia), utilizzando sia la Open NCI Chemical database che la NCI Diversity Set II collection, usando la struttura del cristallo del 67LR e focalizzando l’attenzione sui residui del peptide G. I composti selezionati saranno validati in vitro su linee cellulari e cellule primarie di AML e in topi xenotrapiantati.