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IDENTIFICAZIONE DI MICRO-RNA CHE REGOLANO L'ESPRESSIONE DEL RECETTORE DELL'UROCHINASI E DEL RECETTORE DI CHEMIOCHINA CXCR4

Saranno selezionati miR potenzialmente in grado di bersagliare ambedue i recettori. Tali miR verranno overespressi in cellule esprimenti sia uPAR che CXCR4. Le cellule verrano poi lisate e i lisati analizzati per Western blot con anticorpi anti-uPAR e anti-CXCR4, al fine di esaminare la reale capacità dei miR selezionati di regolare l’espressione dei due recettori. Sarà poi verificato che tali miR bersaglino direttamente l’mRNA di uPAR/CXCR4, preparando la 3’UTR dell’mRNA di ognuno dei recettori e inserendola in un vettore con gene reporter. In particolare, ogni 3’UTR sarà inserita nel vettore pGL3, a valle del gene della firefly luciferasi, la cui espressione sarà quindi regolata da miR che riconoscano la 3’UTR. Cellule ospiti saranno quindi co-trasfettate con tali costrutti, con i miR identificati o con un miR controllo, e con un costrutto contenente un gene controllo per la normalizzazione (Renilla luciferasi). Tali cellule saranno lisate e sottoposte a saggi di luciferasi utilizzando un luminometro.L’espressione dei miR convalidati sarà poi analizzata in linee cellulari di leucemia mieloide acuta (AML) mediante RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) e i loro livelli saranno messi in correlazione con l’espressione dei loro bersagli, uPAR e CXCR4. I miR identificati e i loro specifici inibitori (LNA-ON) saranno inoltre trasfettati in linee cellulari di AML, per verificarne l’effetto sull’espressione di uPAR/CXCR4 mediante Western blot con anticorpi specifici. Le cellule trasfettate saranno anche sottoposte a saggi funzionali, in particolare saggi di migrazione in camera di Boyden e saggi di proliferazione, per verificare il loro effetto su funzioni cellulari nelle quali ambedue i recettori sono coinvolti. Infine, l’espressione dei miR così identificati sarà analizzata in blasti purificati da pazienti affetti da AML e messa in relazione ai livelli di espressione di uPAR/CXCR4.L’insieme dei risultati permetterà di individuare miR il cui decremento permette l’incremento di espressione di molecole, quali uPAR e CXCR4, associate con un fenotipo tumorale più aggressivo. Tali miR potrebbero quindi essere presi in considerazione in nuove strategie terapeutiche anti-tumorali.