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RUOLO DELLA LEPTINA E DI REST NEL CONTROLLO DELLO SVILUPPO E DELLA FUNZIONE IPOTALAMICA

Il nostro obiettivo è quello di indagare in dettaglio dal punto di vista molecolare la possibilità che la leptina possa controllare l'espressione del fattore di trascrizione REST durante lo sviluppo neuronale. Studi in vitroPer gli esperimenti in vitro utilizzeremo una linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y, transfettata con un costrutto iper-esprimente il recettore per la leptina (LepR), e valuteremo come e se la leptina regoli l'espressione di REST. Inoltre, verranno effettuati esperimenti per chiarire il coinvolgimento dell’asse leptina/REST nel differenziamento di cellule staminali embrionali.Saranno condotti anche esperimenti volti a valutare l’attivazione dei segnali associati al recettore della leptina. Più in particolare, cellule staminali trattate con leptina saranno analizzate mediante western blot con un anticorpo monoclonale specifico per l’isoforma fosforilata della proteina STAT3.Inoltre, verrà analizzato il ruolo della leptina nel modulare REST in cellule staminali 129/SvJ embrionali (ES), che saranno propagate su fibroblasti di topo irradiati. ES saranno differenziate in neuroni in 3-4-giorni con 1μM acido retinoico (RA). Le cellule staminali saranno primariamente testate per l'espressione del LepR mediante citometria a flusso ed immunocitochimica (IHC), e quindi analizzati in seguito all’aggiunta di leptina valutando l’espressione di REST e dei suoi geni bersaglio come sinapsina 1, sinaptotagmina V, SNAP-25, MOR-1, Gria 2, mediante Real Time PCR.Analisi di tipo bioinformatico saranno utilizzate per valutare la presenza di STAT3 nella sequenza consenso del promotore di REST. Una volta valutato ciò, eseguiremo esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con un anticorpo specifico per STAT3, per confermare il legame diretto di STAT3 nella sequenza del promotore di REST, dopo l’aggiunta di leptina. Più in dettaglio, la sequenza putativa di STAT3 individuata nel promotore di REST sarà mutata mediante mutagenesi sito-specifica, e testata attraverso un saggio di luciferasi per analizzare l'attività trascrizionale di REST indotta da STAT3 in risposta alla leptina.Studi in vivoPer dimostrare il legame tra leptina e REST in vivo, saranno utilizzati diversi ceppi topi che mancano di leptina (Lepob/ob) o di LepR (LepRdb/db). Per escludere il possibile effetto compensatorio dovuto all’assenza cronica di leptina sull’espressione REST, analizzeremo l’espressione della proteina REST in differenti regioni del cervello di topi WT sottoposti a dieta ipocalorica subito dopo la nascita. Tessuti provenienti da differenti regioni del cervello (mesencefalo, romboencefalo e prosencefalo) saranno analizzati per l’espressione di REST.Esperimenti di colocalizzazione, saranno effettuati per valutare la fosforilazione STAT3 in associazione con la riduzione di REST in seguito alla somministrazione di mrLep in vivo, utilizzando uno specifico anticorpo che riconosce i nuclei arcuati (ARH) dell'ipotalamo, la regione del cervello principale, in cui la leptina agisce nel controllo del comportamento alimentare.Infine, esploreremo la possibilità che l’asse leptina/REST sia fondamentale per lo sviluppo e la funzione dei neuroni dell’ARH, in particolare dei neuroni di tipo (AgRP)neuropeptide Y (NPY) e di tipo proopiomelanocortin (POMC). In particolare, useremo topi con deficit selettivo del LepR nei neuroni NPY e POMC ottenuti mediante il sistema CRE-locus. I livelli di espressione di REST saranno valutati mediante tecniche di immunocolocalizzazione di sezioni di cervello incubate sia con anticorpi specifici rispettivamente per i AgRP sia per MSH che per REST. Poi le sezioni saranno incubate con un anticorpo secondario legato al fluorocromo Alexa 488. Per valutare l’effettiva perdita funzionale del LepR esamineremo fosforilazione del fattore di trascrizione di STAT3 nei neuroni ipotalamici.