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BPIFB4 E RISPOSTA ALL'IPOSSIA: POSSIBILE MECCANISMO DI ADATTAMENTO CELLULARE

BPIFB4 è espressa nelle cellule progenitrici endoteliali (EPCs) e il suo silenziamento ne inibisce la migrazione in vitro. Inoltre, l’isoforma LAV-BPIFB4 stimola in vivo la rivascolarizzazione del muscolo scheletrico in seguito ad ischemia, aumentando l’homing delle EPC e l’attivazione di VEGF e SOD3. Tutto ciò suggerisce una possibile correlazione tra HIF-1a e BPIFB4 in ipossia, che non e mai stata esplorata. Il progetto prevede l’estrazione da campioni di sangue periferico umano delle EPCs, secondo una metodica già descritta che prevede l’isolamento delle mononuclear cells tramite un gradiente di Ficoll e la loromessa in coltura su un coating di fibronectina in un terreno di crescita in grado di favorire la selezione delle EPCs. Le cellule verranno infettate con particelle lentivirali contenenti i costrutti codificanti per la proteina WT-BPIFB4, la sua isoforma LAV o un costrutto vuoto di controllo e incubate in normossia o ipossia (2% di O2) per 48 ore. La sopravvivenza, l’apoptosi e l’espressione di geni nelle EPCs verrà quindi valutata tramite tecniche di FACS. L’ipossia e l’espressione di HIF-1a svolgono un ruolo fondamentale anche nei processi di migrazione e angiogenesi delle cellule tumorali. Alcuni dati preliminari, da noi ottenuti, hanno evidenziato un aumento dell’espressione della proteina BPIFB4 endogena in cellule Hela incubate in ipossia. Si tratta di un dato nuovo, che ci porta ad ipotizzare che BPIFB4 possa essere sotto il controllo diretto o indiretto di HIF-1a. Le cellule Hela verranno perciò trasfettate con un costrutto codificante per una forma costitutivamente attiva di HIF-1a o per uno short-hairpin in grado di bloccarne l’espressione. Il livello di mRNA di BPIFB4 verrà quindi analizzato tramite real-time qPCR mentre i corrispondenti livelli proteici verranno determinati tramite Western blot, sia in normossia che in ipossia. Per verificare inoltre un possibile effetto dell’overespressione delle varie isoforme di BPIFB4 su HIF-1a, le cellule Hela verranno trasfettate con i vettori plasmidici codificanti per la proteina WT-BPIFB4 e la sua isoforma LAV fuse in C-terminale con la green fluorescent protein (GFP). Un vettore codificante solo per GFP verrà usato come controllo e l’emissione di fluorescenza verde ci permetterà di valutare l’efficienza di trasfezione. Le cellule verranno incubate per 48 ore in normossia o ipossia, l’espressione di HIF-1a verrà quindi analizzata tramite real-time qPCR e Western blot.