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COMPOSTI SOLVATOCROMICI COME PROBE PER MEMBRANE LIPIDICHE

Lo studio dei raft lipidici resta uno dei problemi più grandi della biofisica, a causa della difficoltà nel trovare una tecnica di analisi che sia ottimale e che porti ad una visualizzazione rapida e chiara di queste importanti strutture delle membrane biologiche. I probe di membrana sembrano essere un ottimo compromesso per rendere visibili queste nanostrutture lipidiche. Tuttavia, sebbene ci sia un elevato numero di probe in commercio, non esiste attualmente un probe in grado di fornire un’ottima visualizzazione differenziata delle fasi Lo e Ld sia in membrane modello che in membrane plasmatiche cellulari. I probe attualmente più utilizzati sono in genere quelli lipofili, appartenenti alla terza classe di probe, la cui ripartizione nella fase Lo o nella fase Ld fornisce loro una colorazione specifica. Il problema di questi probe, a parte qualche eccezione, è che in genere tendono ad escludere i raft lipidici, mostrando tropismo per la fase Ld, e quindi non consentendo una buona visualizzazione della fase Lo della membrana; questo problema potrebbe essere superato cercando di costruire una struttura molecolare che stia perfettamente in un mezzo sottilmente impaccato e ordinato, come la fase Lo della membrana.La seconda tipologia di probe più utilizzati è quella dei probe solvatocromici, ossia sensibili alla polarità dell’ambiente circostante. Tuttavia, negli ultimi anni, questa classe di probe è stata scarsamente arricchita di nuove molecole, a causa delle difficoltà riscontrate sia nella loro progettazione che nello sviluppo di tecniche in grado di caratterizzarne le proprietà solvatocromiche. Dunque, sebbene in commercio siano presenti svariati tipi di probe, il numero di quelli realmente utilizzabili è esiguo, sia a causa della natura semplificata delle membrane lipidiche modello rispetto alla complessità delle membrane cellulari, sia a causa dell’internalizzazione dei probe una volta messi a contatto con una reale membrana plasmatica. In questo lavoro, saranno progettati e sintetizzati nuovi probe fluorescenti di membrana ed saranno analizzate le loro caratteristiche di fluorescenza all’interno di vescicole in grado di mimare la struttura delle membrane biologiche. Il probe sarà costituito da un nucleo aromatico fluorescente di 7-nitrobenz-2-ossa-1,3-diazolo (NBD) che emette nella regione visibile dello spettro; ad esso sarà legata una struttura zwitterionica e una catena satura a 18 atomi di carbonio, che gli consente di non essere internalizzato nella cellula e di ancorarsi in maniera selettiva al foglietto esterno del bilayer fosfolipidico.L’NBD può essere classificato come “probe solvatocromico” grazie alla sua relativa capacità di cambiare le proprietà di fluorescenza (lunghezza d’onda e intensità) in base alla polarità dell’ambiente circostante. L’NBD, nel passaggio da stato fondamentale a stato eccitato, subisce una variazione del suo momento dipolare a causa di un trasferimento di carica tra un gruppo donatore ed un gruppo accettore all’interno della molecola stessa; le molecole di solvente si orientano intorno al fluoroforo, che ha cambiato il suo momento dipolare, in modo da solvatarlo e generare un rilassamento dello stato eccitato che si traduce come red-shift nello spettro di emissione. Tale red-shift è manifestato più dai solventi polari che da quelli apolari, in quanto questi ultimi inducono un minore rilassamento e una minore solvatazione della molecola nello stato eccitato.Gli NBD-ammino derivati mostrano una bassa intensità di fluorescenza in acqua.La strutture del probe sarà progettata tramite simulazioni di Dinamica Molecolare (MD), in modo da non perturbare lo stato fisico della membrana in cui si va ad inserire. Oltre alla testa zwitterionica, che ne garantisce l'ancoraggio allo strato esterno del biayer fosfolipidico, sarà corredato di una lunga catena alifatica, che ne consentirà una buona interazione con le code de fosfolipidi di membrana.