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STUDIO DELL'INIBIZIONE DELLA CRESCITA DEL LIEVITO SACCHAROMYCES CEREVISIAE IN COLTURE AD ALTA DENSITA' CELLULARE: ASPETTI DI BASE E RICADUTE APPLICATIVE

L'attività di ricerca, svolta nel laboratorio di Biotecnologie e Microbiologia Industriale sarà tesa a sondare in maniera sistematica le cause all’origine del progressivo rallentamento della crescita del lievito in un reattore alimentato (fed-batch). Più precisamente, il lavoro sperimentale consisterà nell’allestimento di numerose prove in fermentatore fed-batch aerato utilizzando in una prima fase il ceppo prototrofo della famiglia CEN.PK del lievito S. cerevisiae, CEN.PK113-7D e, successivamente, altri ceppi della stessa famiglia ma con grado diverso di auxotrofia. Per ogni ceppo si studierà la cinetica di crescita e quella di morte, gli indicatori di stress ossidativo quali catalasi e ROS (Reactive Oxygen Species) e si procederà alla determinazione delle concentrazioni del glucosio residuo e dell'etanolo eventualmente prodotto. Si avvierà poi un’indagine via HPLC su altre componenti chimiche presenti nei brodi capaci di influenzare la crescita microbica. Le prove in fed-batch saranno condotte in un fermentatore Biostat-Q plus provvisto di Unità per il controllo individuale di tre vessels. Il Biostat-Q plus è una nuova acquisizione del laboratorio T5b, resa possibile con i fondi del PON 2011 che consentirà di abbreviare i tempi di realizzazione del progetto, permettendo di effettuare tre prove di fermentazione in parallelo. La velocità di crescita della popolazione microbica sarà controllata attraverso il profilo di alimentazione e fatta variare in un range di valori tali da non superare la soglia critica, che determina lo shift tra metabolismo ossidativo e quello fermentativo. La coltivazione condotta in condizioni di alimentazione controllata avverrà dopo una fase batch atta a produrre un quantitativo di biomassa, ovvero un inoculo idoneo per l'avvio della successiva fase fed.Il ceppo CEN.PK113-5D, inoltre, recante una sola auxotrofia sarà trasformato per la produzione di una proteina eterologa di interesse nel settore agro-alimentare, una endoglucanasi da Poenibacillus barcinonensis ottenuta secondo una strategia di espressione realizzata in collaborazione con l’Università di Valencia. In questo caso, gli esperimenti a diverse velocità di alimentazione saranno utili anche per selezionare le migliori condizioni di produttività della proteina ricombinante.In parallelo alle prove sperimentali verrà sviluppato un modello matematico basato sui principi della System Dynamics, capace di simulare la crescita in presenza di fenomeni di inibizione tenendo presente i principali processi fisiologico-funzionali del lievito in crescita su terreni contenenti glucosio (uptake, catabolismo fermentativo e respiratorio, etc). Tali processi, descritti come flussi, saranno assemblati in un ambiente di modellazione flessibile e modulare. I risultati della sperimentazione e della modellazione consentiranno da una parte l’ottimizzazione del bioprocesso con la stesura di protocolli sperimentali e, dall’altra, la formulazione di nuove ipotesi sulle dinamiche di crescita cellulare.