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MECCANISMI MOLECOLARI DEL'ASSEMBLAGGIO DEL RIVESTIMENTO COPII IN CONDIZIONI NORMALI E PATOLOGICHE

Piano SperimentaleLa CLSD è causata da due differenti mutazioni missenso nel gene SEC23A (SEC23A F382L e SEC23A M702V. Pertanto saranno generate linee cellulari esprimenti in maniera stabile forme mutate del gene Sec23A. Recentemente, per generare mutazioni sito-specifiche è stato utilizzato in maniera soddisfacente il sistema CRISPR-Cas sia in cellule umane che murine. Il sistema Cas/CRISPR è un sistema immunitario procariotico in cui un RNA guida (gRNA) recluta le nucleasi Cas9, per complementarità di sequenza, al luogo di destinazione del genoma nel quale si intende provocare la mutazione, le quali inducono la rottura del doppio filamento (DSB). Questi DSB causano piccole inserzioni o delezioni dette indels. Attraverso l’utilizzo del sistema Cas/CRISPR sarà creata una linea cellulare di condrosarcoma di ratto (RCS) in cui l'esone 10 porterà una transizione in 1144T-C nel gene Sec23A che genera la transizione F382L. Similmente verranno selezionate linee cellulari che esprimono la forma mutante SEC23A M702V . Verrà pertanto valutato l'impatto delle mutazioni di SEC23A sul traffico vescicolare fra Reticolo Endoplasmatico e complesso di Golgi. A tale scopo verrà analizzata la localizzazione intracellulare di marcatori del Compartimento intermedio (ERGIC) come ERGIC-53 e recettore del KDEL nelle cellule mutanti. Sarà inoltre esaminata nelle cellule CLSD la distribuzione intracellulare della proteina endogena Sec16 in relazione alla distribuzione intracellulare della proteina regolatrice Sar1, delle forme mutate di Sec23, e di Sec31, marcatore del rivestimento esterno di COPII. I livelli di colocalizzazione delle proteine endogene saranno analizzati per microscopia confocale.Sarà inoltre analizzata sia la cinetica di associazione che il ciclo di dissociazione delle forme mutate di Sec23 sulle singole ERES mediante recupero della fluorescenza dopo sbiancamento (FRAP) e perdita della fluorescenza nello sbiancamento (FLIP) come descritto precedentemente (Hughes et al. 2009). Allo scopo di valutare il ruolo delle forme mutate di Sec23A sulla capacità di reclutamento del complesso COPII di proteine cargo utilizzeremo come modello sperimentale il mutante temperatura sensibile (ts045) della proteina secretoria virale VSV-G espresso come proteina di fusione alla GFP (ts045G).Il trasporto di procollagene di tipo II (PCII) verra paragonato al trasporto della VSV-G lungo la via secretoria Successivamente saranno esaminati nelle cellule CLSD i livelli di autofagia misurando l'attivazione di LC3, un tipico marcatore autofagico. LC3 è una proteina associata ai microtubuli, esistente in due isoforme: LC3-I e LC3-II. Una modificazione post-traduzionale con fosfatidil-etanolamina (PE) converte LC3-I in LC3-II, che è specificamente associato con le membrane dell’AP. Così i livelli di LC3-II possono essere utilizzati come marker di autofagia. Saranno inoltre misurati i livelli di p62, un substrato endogeno dell’autofagia e mediante microscopia confocale si osserverà la biogenesi di dell’AP utilizzando anticorpi specifici (Wipi, ATG9, Beclin, ULK1 e LC3). L’ultimo step sarà comprendere il ruolo dell'autofagia nella degradazione di PCII nei condrociti CLSD. L'autofagia sarà farmacologicamente indotta trattando le cellule con LiCl2, Tat-Belclin1, rapamicina oppure sovraesprimendo geni coinvolti nel processo come ATG5, Beclin1 e TFEB. Si valuterà mediante immunofluorescenza se l'induzione dell’autofagia diminuisce l'accumulo intracellulare di collagene nelle cellule CLSD.Inoltre sarà esaminato il livello di accumulo di proteine malconformate e lo stato di attivazione dell'Unfolded Protein Response (UPR) in cellule normali o esprimenti forme mutanti di Sec23.Il sistema sperimentale proposto rappresenta un utile strumento per la sperimentazione e la valutazione del potenziale terapeutico di farmaci da impiegare per la cura sintomatica della CLSD o di altre patologie legate a difetti di COPII.