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EFFETTO DI NUOVI INIBITORI DEL RECETTORE AD ALTA AFFINITÀ PER LA LAMININA NELLE EMOPATIE MALIGNE

Il disegno di farmaci basati sulla struttura dei bersagli è considerato un passo cruciale nello sviluppo di nuove molecole ad attività terapeutica. Lo screening computazionale di database di molecole dirette contro la struttura tridimensionale di una proteina può fornire una rapida e accurata previsione delle modalità e affinità di legame per l’ottimizzazione di "composti guida". Lo Screening Virtuale Basato sulla Struttura (SB-VS), che include tecniche di “docking molecolare” ad alto rendimento, è un modo di esplorare i domini di legame di una proteina e di fare delle predizioni sul legame a ligandi specifici. Abbiamo condotto uno SB-VS (in collaborazione con il Prof. A. Lavecchia, Dipartimento di Farmacia, Università “Federico II”, Napoli), utilizzando sia la Open NCI Chemical database che la NCI Diversity Set II collection, usando la struttura del cristallo del 67LR e focalizzando l’attenzione sul peptide G del 67LR. Abbiamo così individuato il composto NSC47924, in grado di inibire selettivamente il legame del 67LR alla LM in cellule epiteliali transfettate con il cDNA codificante per il 37LRP/67LR.Scopo del progetto è lo studio degli effetti sulla diffusione e crescita leucemica e mielomatosa del composto NSC47924 e dei suoi analoghi "drug-like".Il progetto sarà articolato in cinque fasi.FASE 1: analisi degli effetti di NSC47924 su adesione, migrazione, proliferazione e sopravvivenza di cellule staminali emopoietiche (CSE) normali e neoplastiche.CSE CD34+ normali da midollo osseo(MO), CSE mobilizzate con G-CSF, linee cellulari, e cellule primarie derivate da soggetti affetti da LMA, LLC e MM saranno sottoposte a saggi di adesione a LM, a saggi di migrazione verso LM in camere di Boyden, a saggi di proliferazione su LM (mediante MTT e incorporazione di 3H-timidina) e a saggi di apoptosi dopo adesione a LM (mediante citometria a flusso dopo marcatura con ioduro di propidio e Western blot con anticorpi anti-caspasi 3), in presenza e in assenza di NSC47924. FASE 2: analisi degli effetti del 67LR sulle interazioni delle CSE normali e neoplastiche con lo stroma midollare mediante colture a lungo termine (LTC).Gli effetti dell'inibizione, da parte di NSC47924, del legame del 67LR alla LM sulle interazioni delle CSE normali e maligne con lo stroma midollare saranno analizzate mediante LTC. Le LTC rappresentano il miglior modello in vitro dell’emopoiesi in vivo; infatti, le CSE possono interagire con cellule stromali irradiate, riproducenti il microambiente midollare, e quindi organizzarsi in nicchie di attività emopoietica. Saranno valutati gli effetti di NSC47924 sulla capacità di CSE CD34+ normali da MO e CSE mobilizzate con G-CSF e di cellule primarie derivate da soggetti con LMA e MM di attecchire e proliferare all’interno dello stroma midollare.Fase 3: analisi degli effetti di NSC47924 sulle vie di trasduzione del segnale attivate dal legame del 67LR alla LM in CSE.CSE CD34+ da MO e mobilizzate con G-CSF, linee cellulari e cellule primarie derivate da soggetti affetti da LMA, LLC e MM saranno piastrate su LM a vari tempi, in presenza e in assenza di NSC47924. Le cellule saranno lisate e analizzate mediante Western blot con anticorpi fosfo-specifici diretti contro i mediatori del segnale intracellulare mediato dal 67LR.FASE 4: identificazione di composti chimicamente e farmacologicamente correlati al composto guida NSC47924 con proprietà “drug-like”.Sarà effettuata (in collaborazione con il Prof. A. Lavecchia, Dipartimento di Farmacia, Università “Federico II”, Napoli, Italia) una ricerca mediante screening gerarchico del database completo NSC, per analogia con NSC47924. I composti saranno selezionati per le prove sperimentali usando una soglia di energia di legame di -7 kcal /mole.FASE 5: Valutazione degli effetti in vivo di NSC47924 e degli analoghi selezionati.Gli effetti inibitori di NSC47924 sulla crescita di cellule di leucemia e mieloma umane saranno valutate in vivo in topi SCID.