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RUOLO GENETICO NEL CONTROLLO DELLO SHOCK OSMOTICO INDOTTO DA AGENTI ANTIMICROBICI POLIMERICI

Precedenti studi hanno dimostrato che l'azione del polimero antimicrobico è quello di aumentare la permeabilità delle membrane batteriche, sia quella citoplasmatiche che quella esterna nei Gram-negativi. La compromissione della barriera esterna viene evidenziata in ambiente a bassa osmolarità dove le cellule batteriche vanno incontro a morte per lisi. Nel progetto sarà valutato con maggiore precisione in che modo le cariche positive della componente attiva del polimero possano alterare tale permeabilità. Per lo scopo si userà un approccio inverso basato sulla variazione dell'espressione genica di geni coinvolti nel metabolismo dei lipidi della membrana esterna di E. coli. Nello specifico sarà studiata una finestra temporale precedentemente individuata, entro cui dopo un tempo breve di contatto con il polimero, la cellula può recuperare completamente il danno della parete se inoculata in un terreno di crescita ricco. E' stato dimostrato che un'ora di contatto con il polimero non riduce la popolazione cellulare in maniera evidente, ma induce danni alla parete nella maggior parte dei sui componenti. Infatti,la stessa popolazione, in assenza di polimero, se lasciata in ambiente a bassa osmolarità si riduce del 70% nelle 24 ore successive. Se dopo il contatto con l'agente antimicrobico si fa precedere un'incubazione di 30 minuti in terreno ricco i danni subiti vengono riparati come evidenziato dal fatto che tutta la popolazione resta invariata in ambiente ipotonico. Quindi, nella fase di riparazione dovrebbero verificarsi degli eventi che portano la barriera alle condizioni precedenti al contatto con l'agente antimicrobico. E' stato descritto che la rimozione degli ioni divalenti Ca e Mg che stabilizzano le cariche negative dei Lipopolisaccaridi (LPS), i principali componenti del foglietto esterno membrana esterna dei Gram negativi, sia in grado di determinare un suo riarrangiamento tale da aumentarne la permeabilità. Questo processo può essere innescato da chelanti quali l'EDTA e da molecole cariche positivamente che spiazzano, sostituendo, il Ca e il Mg. E' stato ipotizzato che in tali condizioni l'aumento di permeabilità possa essere legata alla rimozione di LPS e loro sostituzione con i fosfolipidi del foglietto interno della membrana esterna, questi ultimi creerebbero delle aree a maggior permeabilità. Un'altra ipotesi è che la rimozione del Ca e Mg determinerebbe un cambiamento strutturale della membrana esterna in una forma meno compatta e più lassa dovuta al riarrangiamento degli LPS piuttosto che alla loro rimozione. Partendo da tali considerazioni, la nostra ipotesi è che le alterazioni indotte dal polimero cationico possano richiedere nella fase di riparazione delle membrane un cambiamento nell'espressione di geni coinvolti nel metabolismo dei lipidi. Per tale motivo, durante tale fase saranno indagati geni implicati nella sintesi, trasporto e modifica dei fosfolipidi (fadR, Fatty acid degradation Regulon; fabR, Fatty acid biosynthesis Regulator; fab A, essenziale per la sintesi degli acidi grassi insaturi; pldA), nonchè degli LPS (waaA; waac, kdsA, pagP), considerati i principali artefici delle variazioni di permeabilità. Mediante l'approccio di Real Time PCR andremo a valutare le variazioni dell'espressione genica nell'arco temporale di tutta la fase di recupero in terreno ricco. Lo studio cinetico delle variazioni degli mRNA ci potrà dare delle informazioni importanti su quelle che sono le principali modifiche indotte nelle membrane cellulari dall'agente antimicrobico specifico, e probabilmente in generale da quelli basati su molecole cationiche. Successivamente tali risultati potranno essere dimostrati mediante metodi biochimici atti a valutare le differenze di composizione delle membrane in cellule prima e dopo il contatto con il materiale antimicrobico.