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ANALISI NUTRIGENOMICA DI POLIFENOLI PRESENTI NELLA DIETA MEDITERRANEA.

Le tecniche di trascrittomica, quali il microarray, forniscono uno studio comprensivo dei geni attivi e/o regolati ed hanno consentito lo studio dei meccanismi molecolari associati a numerose patologie. L’analisi dell’espressione genica consente un’accurata comprensione dei networks regolatori consentendo l’identificazione di biomarkers diagnostici e prognostici e di potenziali targets per interventi medici e/o nutrizionali. Inoltre gli studi di trascrittomica hanno consentito la comprensione delle interazioni complesse fra fattori ambientali e fattori genetici quali lo stile di vita e la nutrizione ed hanno consentito la formulazione di interventi nutrizionali a livello di espressione genica globale.L’analisi di espressione genica a livello “genome-wide” può essere determinante nella scoperta di tutti i meccanismi associati alle attività dei fitochimici presenti nella dieta mediterranea.Nella prima fase della ricerca, colture primarie di cellule endoteliali vascolari umane ottenute dalla vena cordonale ombelicale (HUVEC), saranno trattate con antiossidanti polifenolici derivati dall’olio d’oliva, (idrossitirosolo) e dal vino rosso (resveratrolo) in condizioni basali ed in condizioni pro-infiammatorie.Si provvederà quindi alla purificazione e caratterizzazione degli mRNA dalle cellule trattate e dai relativi controlli da impiegare successivamente negli esperimenti di microarray. Il profilo di espressione genica globale di queste cellule, sarà effettuato utilizzando microarrays prodotti dall’Agilent nei quali sono presenti 44.000 geni e trascritti. Tutti i geni e i corrispondenti probes sono stati mappati sul genoma umano e validati sperimentalmente. Inoltre le sonde sono state disegnate utilizzando algoritmi molto potenti che hanno consentito di massimizzare la sensibilità e di minimizzare potenziali cross-ibridazioni. Per ogni condizione saranno utilizzate almeno tre repliche.Per l’identificazione dei geni targets dei polifenoli, i risultati degli esperimenti di microarray saranno analizzati utilizzando il software GeneSpring14.8® (Agilent Technologies) e per l’identificazione di processi biologici rilevanti sarà utilizzato un software specifico che consente l’analisi di liste di geni nel contesto del Gene Ontology (GO). Per l’identificazione di pathways metabolici e networks molecolari sarà utilizzato il software IPA che offre una rapida valutazione dei pathways metabolici, dei networks molecolari e dei processi biologici che sono significativamente rappresentati nei dataset in esame. IPA da l’accesso ai risultati più recenti disponibili riguardanti geni, farmaci, sostanze chimiche, famiglie proteiche, processi cellulari normali e patologici e pathways metabolici e di segnale.I dati di microarray più rilevanti saranno validati mediante Real-Time PCR e con esperimenti di western blot.. La Real-Time sarà eseguita utilizzando la SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystem) Al completamento dell'intero progetto, per verificare l’effettiva valenza dei singoli polifenoli antiossidanti quali sostanze terapeutiche sarà valutata la possibilità di estendere gli esperimenti ottenuti nelle linee cellulari in modelli animali e/o avere un impatto clinico.