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ANALOGHI SINTETICI DELL'ISOPENTENILADENOSINA: STUDIO PROTEOMICO ED EPIGENETICO DEGLI EFFETTI ANTITUMORALI IN VITRO ED IN VIVO

Primo obiettivo sarà valutare in vitro la cinetica di attivazione o spegnimento dei promotori di specifici geni coinvolti nella carcinogenesi del colon e della mammella. In particolare, diverse linee di carcinoma del colon (CaCO2, HT29, HCT116, DLD1, SW620 e SW480) e della mammella (MCF7, MDA-MB231, SKBR3, T47D) a diverso grado di malignità, saranno trattate con i6A ed analoghi di sintesi (CM223, CM224, CM226, FP11, FP16), di cui abbiamo già dimostrato l'efficacia antiproliferativa. Estratti dei campioni trattati verranno utilizzati per eseguire ChIP nelle quali verrà valutata la dinamica di attivazione o repressione di specifici geni target (e.g. FPPS, EGFR, VEGFR, Nuclear Receptors, BMP4, STAT, fattori trascrizionali). Lo stato di metilazione-acetilazione dei promotori verrà inoltre valutato negli stessi campioni trattati con i composti usati da soli o in combinazione con specifici inibitori delle HMTase, HDAC, DNMT.In una seconda fase, allo scopo di identificare i bersagli cellulari degli effetti antitumorali osservati, estratti delle linee cellulari su descritte, trattate con analoghi di sintesi dell'i6A o con il solo veicolo, verranno utilizzati per eseguire analisi proteomica mediante elettroforesi bidimensionale. I presunti bersagli proteici identificati verranno validati mediante Western blot e Real-time PCR; le isoforme solubili delle proteine potenzialmente regolate verranno quantizzate mediante test ELISA in micropiatra. Per tutti gli esperimenti, i risultati ottenuti saranno confermati spegnendo i singoli bersagli cellulari, mediante siRNA specifici, o iperesprimendo, con vettori di espressione, i potenziali target dell’effetto composto-mediato.Nonostante i promettenti risultati ottenuti in vitro, l’efficacia antitumorale in vivo dell'i6A è ancora controversa e pochi analoghi di sintesi sono stati testati in modelli animali. In particolare, i6A ed alcuni suoi analoghi sintetici non sono in grado di inibire la crescita tumorale in topi nudi inoculati i.p. con cellule di carcinoma ovarico umano (IGROV1); al contrario, in modelli murini di xenograft inoculati per via s.c. con KiMol, il trattamento con i6A, somministrata in sede peritumorale, ha dimostrato una significativa riduzione delle dimensioni del tumore. Nel presente progetto ci si propone, per la prima volta, di valutare in vivo l'efficacia antitumorale di diversi analoghi dell'i6A e di confermare nei modelli murini i bersagli molecolari identificati in vitro. In particolare, in topi nudi i tumori saranno indotti mediante inoculo s.c. di 1x105 cellule appartenenti alle linee tumorali descritte. Alla comparsa di noduli neoplastici gli animali saranno trattati con analoghi di sintesi dell'i6A selezionati: le dimensioni del tumore primario saranno valutate settimanalmente ed al termine le neoplasie escisse testate per marcatori di neoangiogenesi, metastatizzazione, caratteristiche immuno-istochimiche. Sugli stessi campioni verrà valutata l'espressione dei target identificati nell'analisi proteomica e lo stato di attivazione di promotori selezionati in base ai risultati ottenuti nella prima tappa del progetto. Allo scopo di esaminare se le sostanze oggetto dello studio possano avere un ruolo nell’inibire in vivo la trasformazione neoplastica, ulteriori studi valuteranno l’effetto della somministrazione di analoghi dell'i6A in modelli animali di carcinogenesi colon rettale chimicamente indotta da azossimetano precedentemente descritti.Pubblicazioni selezionate:Laezza C, et al. Eur J Cancer 2012, 48(16):3112-22Malfitano AM, et al. Pharmacol Res 2012, 65(3):365-71.Proto MC, et al. J Cell Physiol 2012, 227(1):250-8Pisanti S, et al. Blood 2011, 117(20):5541-50Laezza C, et al. Endocr Relat Cancer 2010, 17(2):495-503.Aquila S, et al. Br J Pharmacol 2010, 159(4):831-41.Santoro A, et al. Int J Cancer 2009, 125(5):996-1003.Laezza C, et al. Int J Cancer 2009, 124(6):1322-9.