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IDENTIFICAZIONE DEI FATTORI CHE INFLUENZANO LA PERSISTENZA DI BATTERI PATOGENI IN FRUTTA E VERDURA

Studi correlazionali di specie batteriche con grande diversità genomica e funzionale richiedono l’analisi fenotipica di un numero elevato di ceppi per raggiungere un potere statistico adeguato. I metodi di microbiologia classica generalmente usati per monitorare individualmente le capacità adattive di un numero importante di batteri in matrici complesse come quelle rappresentate da piante o suolo non è pratico in termini di tempi e costi. Per superare questa limitazione abbiamo sviluppato una nuova strategia basata sull’inserzione di codici a barre molecolari, senza alterare le caratteristiche del recipiente, nel genoma dei ceppi da testare. La presenza di questo codice unico ad ogni ceppo permette di differenziare ogni ceppo usando RT-PCR e quindi di poter effettuare test di sopravvivenza su diversi batteri in contemporanea (Figura 1, in allegato). Questo nuovo approccio permette di ridurre considerevolmente il numero di esperimenti da effettuare. Inoltre, la selettività dei codici a barre molecolari permette di testare la sopravvivenza di E. coli in matrici non sterili, dove è presente il microbiota naturale. Ciò non solo rappresenta una situazione più vicina alla realtà, ma è stato dimostrato che la sterilizzazione di acqua o terreno migliora la crescita di E. coli, suggerendo che la presenza di microorganismi vivi è un fattore importante da considerare. Infine, testare ceppi in contemporanea nello stesso campione permette di minimizzare le variabilità tecniche e biologiche.A. Determinazione della capacità di isolati naturali di E. coli di persistere in associazione con vegetali.Per determinare come vari ceppi di E. coli differiscono nella loro abilità a persistere nel tempo in associazione con piante, gruppi di isolati di E. coli marcati verrano applicati a piante di spinaci (Spinacia oleracea cv. Picasso) cresciute in terreno non sterile per 4 settimane. Sospensioni batteriche (106 UFC/ml) verranno applicate sia sulle foglie che nel terreno. Il livello di ogni ceppo verrà monitorato mediante RT-PCR ad intervalli regolari nella fillosfera, rizosfera e nel terreno. La proporzione di ogni ceppo in un gruppo rappresenterà la loro competitività.Un approccio simile verrà utilizzato per determinare l’abilità di E. coli di raggiungere siti nel tessuto vegetale che possono proteggere contro gli effetti di battericidi ed altri stress abiotici. Questo permetterà di determinare se certi ceppi di E. coli hanno vantaggi specifici. In breve, gruppi di E. coli marcati verranno applicati su foglie di spinaci come descritto qui sopra, con la differenza che verranno usate concentrazioni batteriche maggiori (108 UFC/ml). Ad intervalli regolari, foglie verranno rimosse asetticamente e trattate con ipoclorito di sodio, un battericida comunemente usato per trattare gli alimenti. Le proporzioni dei vari ceppi sulle foglie trattate verranno poi confrontate con quelle sulle foglie non trattate con battericida.B. Studio di associazione per correlare tratti genetici con la capacità di E. coli a persistere sui vegetali o nel suoloQuesta parte del progetto si avvantaggerà del fatto che abbiamo sequenziato il genoma di tutti i ceppi di E. coli che verranno usati in questo studio. Questo ci permetterà di determinare se ci sono tratti genetici che sono correlati con alta o bassa competitività in associazione con tessuti vegetali o il suolo. Questa analisi verrà fatto in collaborazione con il laboratorio del Prof. Sheppard all’Università di Bath (Regno Unito), il quale ha sviluppato un approccio statistico testato con successo su altre specie batteriche.C. Validazione degli studi di associazioneCorrelazioni identificate nella parte B verranno testate direttamente generando mutanti isogenici dove abbiamo deletato geni di interesse e confrontando la loro capacità a colonizzare piante o suolo con quella del ceppo parentale. Coscienti del fatto che mutazioni singole possano avere un limitato effetto sul fenotipo, useremo il metodo -Red per generare mutanti con delezioni multiple.