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RUOLO DI UNA PROTEINA DEL KIWI, KISSPER, NELLA MODULAZIONE DELL'INFIAMMAZIONE INTESTINALE

Gli obiettivi specifici del progetto saranno pertanto:a)Caratterizzare gli effetti del kissper nella modulazione di molecole pro-infiammatorie come ICAM, HLA-DR, PY99 implicate nelle fasi precoci dell’infiammazione dell'intestino (ileo/colon)b)investigare l' effetto sulla cascata delle MAPkinasi ( P38/44), e paragonarli a quelli di altri anti-infiammatori, o molecole naturali in grado di mediare un effetto simile.c)Valutare l' effetto della molecola sul controllo dell' equilibrio ossidoriduttivo, di marcatori diretti di produzione dei ROS (diclofuoresceina diacetato) e mediante enzimi in grado di modulare lo stress ossidativo (GST transferasi, Glutione intracellulare etc.)d) valutare gli effetti del kissper in vitro in relazione al grado e all'estensione della malattia infiammatoriaL'approccio adottato è di tipo interdisciplinare, combina competenze di tipo chimico e medico, e, il programma proposto sarà lavoro interattivo con scambio di materiali e tecniche con il CNR di Napoli.Metodi : Coltura di frammenti di ileo terminale e colon.In studi precedenti il modello della coltura “ex-vivo” è già stato utilizzato per l' analisi della risposta mucosale ad antigeni della celiachia, individuando possibili strategie di modulazione della risposta infiammatoria con potenziale impatto terapeutico. I markers dell'infiammazione mucosale(ICAM, HLA-DR; PY 99) verranno qui testati. Gli espianti tissutali saranno coltivati entro 20 minuti dopo l'espianto; i campioni saranno suddivisi in 8-10 frammenti; il primo sarà congelato a -70°C, gli altri saranno posti in capsule di Petri con pozzetto centrale con griglia metallica e orientati con la superficie epiteliale rivolta verso l'alto e saranno coltivati in accordo con la metodica descritta dal gruppo proponente per 4 h e 24 h in presenza di solo mezzo di coltura e/o in presenza delle sostanze stimolanti addizionate o non con inibitori, come dettagliato in seguito. Al termine del periodo di coltura le biopsie saranno divise ognuna in 2 frammenti e, rispettivamente,congelate a -70°C o prima incluse in OCT (OCT compound, Miles Lab) e quindi congelate a -70°C. I frammenti in coltura saranno incubati per 20 min, 4 h e 24 h in presenza o in assenza di digesto di lisato battertico e/o LPS (1 microg/ml di mezzo di coltura). Altri frammenti provenienti dallo stesso espianto saranno coltivati per gli stessi tempi con lisato batterico e/o LPS da E.coli in aggiunta a Kissper,(2microg/ml).ImmunoistochimicaIl passo successivo sarà l'analisi dell'espressione dei marcatori dell'infiammazione prodotti da colonociti in seguito all'interazione linfociti/ enterociti in presenza di sostanze come LPS e kissper. L'espressione delle chemochine/fattori di crescita sarà valutata mediante immunoistochimica: sezioni di tessuto di campioni bioptici saranno incubati con anticorpi specifici per valutare l'espressione di differenti markers: NF-kB (subunità p65 ),fosfotirosina PY99, COX-2, CD68, CD83 (marker di maturazione di cellule dendritiche), fosfo-p38 MAPK, CD25 (recettore per IL-2 )CD3. L'espressione e la distribuzione dell'antigene sarà visualizzata mediante immunofluorescenza indiretta o, se necessario, con doppia immunofluorescenza. Intensità dell'infiammazioneSi valuteranno 2 parametri, l'intensità della infiammazione, cioè l'aspetto endoscopico della lesione (MAYO score + l'istologia), e la sua estensione (cioè numero, sede e lunghezza delle zone infiammate valutate con ecografia intestinale eseguita con sonda lineare). L'ecografia, ormai standardizzata nelle sue variabili, consente di valutare l'estensione di malattia in maniera non invasiva e soprattutto lungo il tenue, non raggiungibile con endoscopia. Si ritiene che l'attività anti-iffiammatoria del kissper possa essere variabile a seconda del grado/estensione dell' infiammazione.