Ricerca | Progetti Finanziati

STUDIO DI STRATEGIE DI INIBIZIONE DI GRK2 NELLE PATOLOGIE CARDIOVASCOLARI

Le attività specifiche (AS) del progetto saranno organizzate in funzione degli specifici obiettivi previsti nel modo seguente: AS1. Identificazione dei meccanismi coinvolti nella localizzazione subcellulare di GRK2. AS1.1 Rimozione di GRK2 dalla membrana plasmatica. Un frammento di GRK2, detto ßARKct, rimuove GRK2 dalla membrana plasmatica attraverso un meccanismo di competizione per il legame alla subunità beta gamma delle proteine G. Identificheremo la regione più piccola di ßARKct in grado di rimuovere GRK2 dalle membrane in cellule HEK293 che overesprimono il recettore beta 2 adrenergico umano (bAR), per effettuare studi di signaling di bAR e studi di localizzazione subcellulare e attività chinasica di GRK2. AS 1.2 Valutazione del ruolo di GRK2 nei mitocondri. La traslocazione di GRK2 in diversi compartimenti cellulari sarà valutata in epifluorescenza in tempo reale e microscopia confocale. Per esprimere proteine in cardiomiociti adulti, utilizzeremo costrutti adenovirali e coloranti mitocondriali (Mitotracker) AS 1.3 Valutazione degli effetti della localizzazione mitocondriale di GRK2 sulle dinamiche del calcio intracellulare e sul potenziale di membrana mitocondriale; le dinamiche del calcio intracellulare saranno valutate mediante l'utilizzo di indicatori sensibili al calcio (Fura-2 e Rhod-2) o sonde chimeriche. Saranno utilizzati mutanti di GRK2 con selettiva localizzazione mitocondriale. AS 2: Produzione di inibitori di GRK2 che bloccano l'interazione recettore-substrato o impediscono la localizzazione sulla membrane plasmatica. Alcune molecole sono già disponibili come indicato nella sezione Stato dell'Arte, (C9), mentre i peptidi che regolano la localizzazione subcellulare saranno prodotti successivamente. AS 2.1: Disegno e sintesi di peptidi analoghi: basandoci sul peptide ciclico C9, ottimizzeremo la lunghezza del ponte amidico e stabilizzeremo la struttura ad ansa presente lungo I residui 2-5. Miglioreremo le proprietà farmacocinetiche e aumenteremo l'attività inibitoria e la selettività di questi peptidi. AS 2.2: Valutazione de gli effetti citotossici dei composti sintetizzati: la tossicità dei composti generati sarà valutata mediante saggio MTT in cellule HEK293 aumentando le concentrazioni dei peptidi sintetizzati. I peptidi che risulteranno non tossici in vitro saranno analizzati per valutare il loro effetto sulle risposte cellulari. AS 3: Questa attività sarà condotta in modelli animali di malattia utilizzando I peptidi sintetizzati più promettenti per verificarne l'efficacia e quindi selezionare I potenziali peptidi che possono essere usati come modelli per disegnare una piccolo molecola o farmacoforo. AS 3.1: Produzione di modelli murini di scompenso cardiaco stabili e affidabili. Lo scompenso cardiaco sarà indotto mediante cryo-infarto(CI) sulla parete anteriore del ventricolo sinistro in topi C57/Bl6. Lo scompenso cardiaco terminale si osserva a 6 settimane dopo CI. Nei topi saranno valutati la funzione cardiaca e il volume mediante ecocardiografia prima della chirurgia, a 3 giorni e a 1, 4, 6, 8, 10 settimane dopo CI. A 10 settimane dopo CI, prima di sacrificare gli animali, si effettueranno misurazioni emodinamiche mediante cateterizzazione. A 6-8 settimane dopo CI, un gruppo di animali verrà trattato in cronico con i peptidi o il veicolo mediante l'impianto sottocute di pompe osmotiche. AS 3.2: Identificare I peptidi efficaci in modelli sperimentali di scompenso cardiaco. Al termine di AS3.1, saranno disponibili I risultati degli effetti dei peptidi efficaci sulla performance cardiaca. Questi peptidi saranno selezionati per l'identificazione di un farmacoforo e la sintesi di nuovi composti.