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RUOLO DELLA CHINASI CALCIO-CALMODULINA-DIPENDENTE (CAMKII) NEL CARCINOMA MIDOLLARE DELLA TIROIDE

Verranno prodotte linee cellulari NIH-3T3, con espressione costitutiva di RETC634Y e RETM918T. Queste linee verranno utilizzare per studiare il segnale che da RET porta all’attivazione di CaMKII e in particolare verrà analizzata l’attivazione di PLC gamma e CaMKII. Successivamente, verificata la capacità generica di RET di attivare CaMKII, verranno utilizzate le due più studiate linee di MTC (TT e MZC-RC), portatrici delle due suddette mutazioni. In queste linee verranno analizzati i livelli di attivazione di PLC gamma, Ras, Raf-1, ERK e CaMKII. Il legame RET/CaMKII verrà dimostrato determinando i livelli di attivazione di CaMKII in condizione di inibizione di RET e PLC gamma mediante inibitori specifici. Il ruolo di CaMKII nel segnale delle MAPK verrà determinato inibendo CaMKII e misurando i livelli di attivazione di Raf-1 e ERK. Infine, l’inibizione di CaMKII darà informazioni sul ruolo sdi questa chinasi nella proliferazione e nella sopravvivenza delle cellule di MTC.Fase 1: Produzione di linee di cellule NIH-3T3 esprimenti l’oncogene RET.Le cellule NIH-3T3 verranno trasfettate con un vettore di espressione di RETC634Y e RETM918T insieme ad un vettore per la resistenza alla neomicina e selezionate mediante questo farmaco (cloni NIH-RET). Fase 2: Stato di attivazione di CaMKII in cellule NIH-RETI livelli di attività di CaMKII verranno determinati mediante WB con anticorpi fosfospecifici per T286-CaMKII. Verranno confrontate le cellule NIH-3T3 con le NIH-RET e queste ultime trattate con un chelante del calcio (BAPTA) e inibitore di RET (ZD6474).Fase 3: Attività di CaMKII in cellule di MTCDetermineremo i livelli di attivazione di CaMKII in due linee di cellule MTC: TT e MZ-CRC, rispettivamente portatrici delle mutazioni RETC634Y e RETM918T. La fosforilazione di T286-CaMKII verrà determinata mediante WB nelle linee trattate con inibitore di RET ZD6474, PLC (U73-122), e BAPTA.Fase 4: Ruolo di CaMKII sul segnale Ras/ERK in cellule di MTC L’attivazione di Raf-1, MEK e ERK1/2 verranno determinati mediante WB con anticorpi fosfo-specifici in cellule TT e MZC-RC in condizioni basali e dopo inibizione di CaMKII con un peptide inibitorio specifico (CaNtide). Fase 5: Effetto dell’inibizione di CaMKII sul ciclo cellulare e sulla vitalità in cellule di MTCLe cellule TT e MZ-CRC verranno trattate con CaNtide a diverse concentrazioni e il numero e la vitalità cellulare verrà determinata mediante conta assoluta e test MTT. Le cellule verranno anche raccolte e la presenza di apoptosi verrà determinata mediante saggio con annexina e visualizzazione dei prodotti di scissione di caspasi 3 al western blot.1.Guerra A, Fugazzola L, Marotta V, Cirillo M, Rossi S, Cirello V, Forno I, Moccia T, Budillon A, Vitale M. A high percentage of BRAFV600E alleles in papillary thyroid carcinoma predicts a poorer outcome. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97:2333-40. I.F. 6.4302.Guerra A, Sapio MR, Marotta V, Campanile E, Rossi S, Forno I, Fugazzola L, Budillon A, Moccia T, Fenzi G, Vitale M. The primary occurrence of BRAF(V600E) is a rare clonal event in papillary thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97:517-24. I.F. 6.4301.Zeppa P, Sosa Fernandez LV, Cozzolino I, Ronga V, Genesio R, Salatiello M, Picardi M, Malapelle U, Troncone G, Vigliar E. Immunoglobulin heavy-chain fluorescence in situ hybridization-chromogenic in situ hybridization DNA probe split signal in the clonality assessment of lymphoproliferative processes on cytological samples. Cancer Cytopathol. 2012;120:390-400 I.F. 4.4342.Petruzziello F, Zeppa P, Catalano L, Cozzolino I, Gargiulo G, Musto P, D'Auria F, Liso V, Rizzi R, Caruso N, Califano C, Piro E, Musso M, Bonanno V, Pia Falcone A, Tafuto S, Di Raimondo F, De Laurentiis M, Pane F, Palombini L, Rotoli B. Amyloid in bone marrow smears of patients affected by multiple myeloma. Ann Hematol. 2010;89:469-74 I.F. 2.866