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RUOLO DEI RECETTORI PER L'FMLF NELLA LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA

Questo progetto mira a studiare l’espressione e la funzione degli FPRs in CSE normali, sia residenti nel midollo osseo (MO) che mobilizzate con G-CSF, e in cellule di leucemia mieloide acuta (LMA), allo scopo di chiarire il ruolo esercitato dagli FPRs nell’interazione con il microambiente midollare, nella migrazione e proliferazione di CSE normali e leucemiche.Gli obiettivi specifici di questo progetto sono:1) Definire il ruolo specifico di ciascun FPR nel contesto della mobilizzazione, homing e attecchimento al MO di CSE normali.A tale scopo, l’espressione di FPR1, FPR2, e FPR3 sarà valutata, mediante RT-PCR e analisi citofluorimetrica, su CSE CD34+ midollari e mobilizzate con G-CSF, provenienti da donatori per il trapianto di cellule staminali, dopo consenso informato. Tale indagine permetterà di studiare il profilo e i livelli espressione degli FPRs in CSE midollari e la loro modulazione nel rilascio dal MO mediato da G-CSF, il più comune agente mobilizzante.Sarà poi studiato il ruolo degli specifici FPR nell’attecchimento allo stroma midollare di CSE CD34+ midollari e mobilizzate, mediante colture a lungo termine (LTC). Le LTC rappresentano il miglior modello in vitro dell’emopoiesi in vivo, infatti le CSE possono interagire con cellule stromali irradiate, riproducenti il microambiente midollare, e quindi organizzarsi in nicchie di attività emopoietica. Saranno valutati gli effetti di agonisti specifici dei diversi FPR (fMLF, uPA-ATF, uPAR88-92, Hp(2-20), peptide WKYKVm) sulla capacità di CSE CD34+ midollari e mobilizzate con G-CSF di attecchire e di proliferare all’interno dello stroma midollare e quindi di generare cellule inizianti colonie in colture a lungo termine (LTC-IC).2) Definire il ruolo specifico di ciascun FPR nel contesto dell’adesione, migrazione, proliferazione e sopravvivenza di cellule di LMA.A tale scopo, l’espressione di FPR1, FPR2, e FPR3 sarà valutata, mediante RT-PCR e analisi citofluorimetrica, su cellule di linee di LMA a vari gradi di differenziamento (KG1, HL-60, NB4, U937, THP1) e poi su blasti provenienti da soggetti affetti da LMA, dopo consenso informato. Tale indagine permetterà di evidenziare un’eventuale modulazione dei livelli di espressione dei vari FPR in cellule di LMA rispetto alle CSE normali, ed anche eventuali cambiamenti nel loro profilo di espressione nel corso del differenziamento emopoietico.Poi, cellule di LMA, sia di linea che primarie, saranno sottoposte a saggi di adesione in vitro, di migrazione in camere di Boyden, di proliferazione (mediante MTT e incorporazione di 3H-timidina) e di apoptosi (mediante citometria a flusso dopo marcatura con ioduro di propidio e Western blot con anticorpi anti-caspasi 3), dopo stimolazione con agonisti specifici dei diversi FPR (fMLF, uPA-ATF, uPAR88-92, Hp(2-20), peptide WKYKVm). Tali indagini permetteranno di studiare gli effetti degli FPRs sul comportamento cellulare nella LMA. 3) Definire le vie di trasduzione del segnale attivate da ciascun FPR in CSE normali e leucemiche.CSE CD34+ da MO e mobilizzate con G-CSF, linee cellulari e cellule primarie di LMA saranno stimolate con agonisti specifici dei diversi FPR (fMLF, uPA-ATF, uPAR88-92, Hp(2-20), peptide WKYKVm). Le cellule saranno poi lisate e analizzate mediante Western blot e co-immunoprecipitazione con anticorpi diretti contro i possibili mediatori del loro segnale intracellulare. Sarà studiato anche l’influsso di Calcio, mediante analisi citofluorimetrica. Tale analisi potrà evidenziare eventuali anomalie nel segnale generato dagli FPRs nelle AML e costituire quindi la base per una terapia mirata verso i trasduttori di segnale attivati, o verso gli FPRs stessi.