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LA VARIANTE DI BPIFB4 NELLA FUNZIONE VASCOLARE: DETERMINAZIONE MOLECOLARE DEI MECCANISMI

Al fine di comprendere quale delle isoforme di 14-3-3 si lega a BPIFB4, faremo degli esperimenti di communoprecipitazione che consistono nel trasfettare cellule HEK293 con costrutti che contengono cDNA per BPIFB4 e una GFP, immunoprecipitare con anticorpi anti BPIFB4 o anti GFP, e valutare, attraverso ibridazione della immunoprecipitazione precentemente trasferita su membrana (western)quale isoforma e' immunoprecipitata insieme a BPIFB4. A tal fine sono disponibili una serie di anticorpi commerciali anti BPIFB4, anti GFP e anti 14-3-3 (7 differenti isoforme).In parallelo procederemo con la caratterizzazione del topo reso diabetico per la valutazione a livello vascolare di quali isoforme di 14-4-3 sono meno espresse rispetto al topo non diabetico. I topi verranno sacrificati e i vasi verranno omogenizzati e caricati su gel per la valutazione attraverso western per la quantizzazione delle isoforme di 14-4-3.I dati di immunoprecipitazione e di caratterizzazione sul topo diabetico come descritto sopra ci permetteranno di procedere allo step successivo che prevede l'infezione attraverso AAV-BPIFB4 mutato di topi diabetici e non. Abbiamo dati preliminari che ci fanno vedere che nel topo diabetico il potenziamento di eNOS da parte della variante di BPIFB4 e' meno efficace rispetto allo stesso esperimento nel topo normale. Procederemo con l'analisi funzionale sul vaso (arteria mesenterica) che prevede uno stimolo con acetilcolina e la registrazione della vasodilatazione secondaria allo stimolo vasocostrittivo con potassio e fenilefrina. La procedura verra' effettuata su vasi da topo normale e da topo diabetico. Nell'analisi dei vasi di topo diabetico verra' trasfettato il costrutto con la isoforma del 14-3-3 che e' stata identificata dagli esperimenti come descritto sopra. L'ipotesi e' che una volta ri-integrato il vaso con la isoforma di 14-3-3 che viene poco espressa nel topo diabetico eche viene immunoprecipitata da BPIFB4, il potenziamento da parte della forma mutata sia equiparabile a quella che si evince sul topo normale. Questi risultati ci permetteranno di intraprendere lo step successivo che consiste nel delivery della proteina mutata insieme all 14-3-3 nei pazienti diabetici per il ripristino della funzione endoteliale