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ANALISI METABOLOMICA DEL PLASMA E DELLE URINE PER L'IDENTIFICAZIONE DI NUOVI MARCATORI DIAGNOSTICI IN PATOLOGIE NEOPLASTICHE DI INTERESSE UROLOGICO

Le neoplasie oggetto della nostra attenzione sono quelle di interesse urologico. Verranno considerate le differenze tra i vari sottotipi anatomopatologici. A tal scopo intendiamo sottoporre campioni di plasma e di urine, provenienti da pazienti affetti da tali neoplasie, ad analisi gas-cromatografiche e di spettrometria di massa, per determinare la presenza e misurare la concentrazione di molecole con peso molecolare inferiore ai 1000 Dalton, appartenenti a differenti classi chimiche. Intendiamo inoltre sottoporre ad analoghe analisi campioni biologici provenienti da volontari sani, allo scopo di ottenere valori normali di concentrazione plasmatica ed urinaria delle piccole molecole oggetto del nostro interesse. Oltre a migliorare il processo diagnostico, l'identificazione di molecole sovra o sotto espresse in specifici quadri patologici potrebbe aiutare a definire il ruolo eziopatogenetico dei processi metabolici alterati collegati alle malattie neoplastiche, migliorando la comprensione dei processi biochimici che accompagnano la trasformazione. Le provette contenenti i campioni biologici provenienti dai volontari sani e dai pazienti selezionati, raccolte nell'ambito della normale attività clinico-assistenziale dopo aver fornito adeguata informazione e raccolto il consenso degli interessati alla partecipazione dello studio, saranno inviate ad un centro convenzionato dove i campioni saranno analizzati con tecniche gas cromatografiche e di spettrometria di massa. Dopo apposito trattamento di estrazione e di derivatizzazione, i campioni saranno sottoposti ad analisi GCMS e GCxGCMS. La caratterizzazione molecolare dei vari picchi sarà ottenuta in prima approssimazione tramite analisi di spettrometria di massa, accoppiata alla gas cromatografia, per mezzo di librerie specifiche per metabolomica. La spettrometria di massa sarà di tipo sia quadripolare che triquadripolare, a ionizzazione elettronica. I picchi identificati come di interesse particolare per gli scopi di questo studio saranno ulteriormente analizzati e tipizzati tramite analisi gas cromatografica accoppiata alla spettroscopia infrarossi a trasformata di Fourier, attraverso analisi di spettrometria di massa ad alta risoluzione GC TOF MS. Infine gli analiti di interesse saranno purificati per mezzo di gas cromatografia di tipo preparativo polidimensionale e tipizzati attraverso NRM ad alta risoluzione. Dai cromatogrammi ottenuti da ciascun campione, saranno estratti dati riguardanti le concentrazioni relative delle varie molecole rilevate. I dati ottenuti dai cromatogrammi saranno analizzati, attraverso tecniche parametriche e non parametriche, anche con l’ausilio dello strumento informatico R (Foundation for Statistical Computing, Vienna). Saranno poi sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA). Per verificare l’esistenza di differenze statisticamente significative tra le concentrazioni di ogni singola molecola identificata tra i campioni corrispondenti alle varie classi di assegnazione dei pazienti, verrà determinato il coefficiente di Pearson, ponendo un limite di α<0.05, corrispondente ad un livello di confidenza del 95%. I dati saranno scalati centrando la media e ponendo la varianza come uguale a 1. Gli stessi saranno poi sottoposti ad analisi delle componenti principali per mezzo della trasformata di Karhunen-Loève e successivamente sottoposti ad analisi di tipo discriminante di tipo PLS-DA, integrandoli con i dati provenienti dalla raccolta dei parametri anagrafici e clinici dei volontari sani e dei pazienti selezionati. I modelli saranno ottimizzati minimizzando il misclaffication rate. Dal modello ottimizzato verranno estratte le VIP ipotizzando come significative quelle con un VIP score superiore a 1.