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ANALISI DELL'ATTIVITA' ANTI-LINFATICA DI VEGFR3

ESPERIMENTI CONDOTTI E RISULTATI OTTENUTI NEL PRIMO PERIODO Obiettivo 1: Determinare gli effetti patologici della manipolazione di Vegfr3 nel topoAbbiamo caratterizzato il fenotipo vascolare in topi che sovraesprimono Vegfr3 in CE, attraverso l’utilizzo di un topo transgenico esprimente Vegfr3 (TgVegfr3) in modo Cre-inducibile e topi Tie2Cre e Tbx1Cre. La sovraespressione di Vegfr3 mediante Tie2Cre risultava letale. Inducendo Vegfr3 con Tbx1Cre abbiamo mostrato che l'attivazione di Vegfr3 sopprime i vasi linfatici nella pelle, cuore, diaframma, mentre nel cervello, sopprime i vasi sanguigni. Quest’ultimo risultato è simile a dati ottenuti nel topo che mostrano che l’inattivazione CE-specifica di Vegfr3 causa iperplasia vascolare cerebrale (Tammela, 2011).Abbiamo proposto di inattivare Vegfr3 in CE in vivo attraverso mutanti condizionali Vegfr3flox/flox e i topi Tie2Cre e VE-CadherinERT-Cre. In quest’ultimo, la ricombinazione pan-endoteliale è farmaco-inducibile. Questi esperimenti sono ancora in corso. Obiettivo 2: Sviluppare un saggio funzionale basato su CE che permette lo studio di meccanismi patogenetici e lo screening di farmaciAbbiamo proposto di analizzare CE in cui è stata sopressa o attivata Vegfr3 mediante RNA interference (inattivazione) o trasfezione con un transgene Vegfr3-esprimente (attivazione). I risultati ottenuti mostrano che l’inattivazione CE-specifica di Vegfr3 causa l’iperbranching dei microtubuli, fenotipo simile a quello ottenuto nel topo knockout CE-specifico di Vegfr3. L’analisi molecolare delle CE mostra la soppressione di alcune molecole nel pathway di Notch. Gli esperimenti per attivare l’espressione di Vegfr3 in CE isolate sono ancora in corso.DESCRIZIONE DEL PROGETTOIl fenotipo di ipoplasia vascolare linfatico riscontrato nei topi sovraesprimenti Vegfr3 era inatteso poichè precedenti studi hanno mostrato che Vegfr3 promuove la proliferazione delle CE e la crescita dei vasi linfatici. Inoltre, l’inattivazione di Vegfr3 nel topo causa ipoplasia dei vasi linfatici.In questo periodo, cercheremo di spiegare questo risultato. Innanzitutto, porteremo avanti gli esperimenti utilizzando altri alleli Cre per modulare in vivo l’espressione di Vegfr3 in CE. Questo approccio è importante per capire se l’ipoplasia linfatica trovata nei mutanti Tbx1Cre; TgVegfr3 è dovuta ad una funzione di Vegfr3 nelle CE o se è dovuta all’attivazione ectopica in tessuti non-endoteliali, come accade quando Vegfr3 è attivata da Tbx1Cre. Se il risultato è confermato con altri Cre EC-specifici, suggerisce che il ruolo pro- o anti-linfatico di Vegfr3 è determinate dal contesto tissutale e potrebbe essere dovuto all’attivazione di geni diversi in tessuti diversi. In base ai risultati ottenuti, valuteremo l’espressione di geni target di Tbx1. I risultati ottenuti finora con le CE isolate coltivate in Matrigel hanno confermato la validità del sistema cellulare tri-dimensionale come modello della rete vascolare in vivo. Proponiamo di eseguire esperimenti di ricupero del fenotipo in CE carenti di Tbx1 che sovraesprimono Vegfr3. Tale esperimento richiede l’inattivazione di Tbx1 e la sovraespressione di Vegfr3 per trasfezione del transgene VR3. Valuteremo la capacità del trattamento di ripristinare il branching dei microtubule. Se il ricupero fosse incompleto avremo la possibilità di valutare il contributo di altre molecule al fenotipo microtubulare. In particolare, vogliamo indagare Dll4 e Vegfr2, due molecole regolate da Tbx1, che svolgono ruoli importanti nell’angiogenesi e nella linfangiogenesi. Metodi sperimentaliPer gli studi in vivo, le linee murine sono disponibili. Analizzeremo i vasi su sezioni istologiche agli stadi embrionali E11.5 e E15.5. Per gli studi basati su CE isolate, utilizzeremo il saggio Matrigel con CE primarie linfatiche e venose. Per abbattere l'espressione di geni d’interesse utilizzeremo RNA interference e per sovraesprimere geni la trasfezione con plasmidi di espressione.