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UNA NUOVA STRATEGIA IMMUNOTERAPEUTICA PER IL TRATTAMENTO DEI TUMORI MAMMARI TRIPLO NEGATIVI

Il progetto si prefigge di valutare se la combinazione di CSPG4-specific CAR+ T e LDE225 sia in grado di eradicare i TNBC attraverso l’eliminazione sia delle cellule tumorali differenziate che delle CCS. Come risultato, la recidiva di malattia e lo spreading metastatico dei TNBC saranno soppressi. Gli obiettivi del progetto saranno i seguenti:1) Valutazione del significato pognostico dell’espressione di CSPG4 nei TNBC e la sua associazione con l'ipossia nel microambiente tumorale;A tal fine, verrà valutata l’espressione della proteina bersaglio, CSPG4, su biopsie incluse in paraffina ottenute da pazienti affette da TNBC e in trattamento neoadiuvante presso la UOC di Oncologia dell'AOU Ruggi d'Aragona di Salerno. Tale fase sarà essenziale per a) calcolare la percentuale di pazienti CSPG4+ che possono beneficiare dalla strategia terapeutica disegnata e b) valutare l'effetto del trattamento neoadiuvante sui livelli di espressione di CSPG4. Inoltre, verrà valutata l’associazione tra ipossia e livelli di CSPG4. A tal fine, verranno utilizzate metodiche immunoistochimiche utilizzando anticorpi monoclonali per CSPG4 e per marcatori di ipossia quali l’anidrasi carbonica IX. L'analisi statistica di correlazione tra carattristiche anatomo/cliniche e risultati sperimentali verranno condotte utilizzando uno specifico database.2) Valutazione dell'attività citotossica delle CSPG4-specific CAR+ T in combinazione con LDE225 su modelli di TNBC CSPG4+ "in vitro".In collaborazione con il Professor Soldano Ferrone, Harvard Medical School,Boston, vettori plasmidici contenenti CSPG4-specific CAR saranno utilizzati per transfettare linfociti CD8+ ottenuti da pazienti affetti da TNBC. Successivamente, dopo amplificazione, le CSPG4-specific CAR+ T così ottenute sarranno utilizzate per trattare tre linee cellulari di TNBC CSPG4+, con o senza l'inibitore LDE225. Al termine dei trattamenti, verranno valutate: la proliferazione delle CSPG4-specific CAR+ T e delle cellule di TNBC; l’attivazione delle CSPG4-specific CAR+ T; l’espressione di molecole immunomodulanti quali PD-1, PD-L1 e Fas ligand; l’induzione dell’apoptosi nelle cellule di TNBC; l'inibizione della proliferazione delle CCS isolate per citofluorimetria grazie all'attività dell’enzima aldeide deidrogenasi 1 (ALDH bright cells). Cellule di TNBC trattate con linfociti T citotossici non transfettati saranno utilizzati come controllo.3) Valutazione dell'attività citotossica delle CSPG4-specific CAR+ T in combinazione con LDE225 su tumori TNBC CSPG4+ derivanti da pazienti ed impiantati in topi immunodeficienti.A tale scopo, topi completamente immunodeficienti (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) saranno trapiantati con tumori ottenuti da pazienti affette da TNBC. Successivamente i topi saranno randomizzati a ricevere i diversi tipi di trattamento singoli (CSPG4-specific CAR+ T o LDE225) o in combinazione (CSPG4-specific CAR+ T + LDE225). Topi non trattati o trattati con linfociti non trasfettati o con chemioterapia standard saranno utilizzati come controlli. I risultati ottenuti serviranno da background al fine di implementare uno studio clinico utilizzando la strategia terapeutica da noi designata per il trattamento dei TNBC. Inoltre l’esperienza derivante da tale progetto consentirà di implementare un nuovo approccio immunoterapico per il trattamento di tumori esprimenti la proteina CSPG4.