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RUOLO DI GRK2 NELLA FUNZIONE MITOCONDRIALE DI CARDIOMIOCITI DI ANIMALI SOTTOPOSTI A RADIAZIONI IONIZZANTI.

Il presente progetto è il primo ad indagare il ruolo di GRK2 negli effetti della radioterapia sulla funzione contrattile. La nostra ipotesi è che GRK2 svolga un ruolo protettivo, tramite il controllo della fusione mitocondriale5 e quindi induca la sopravvivenza cellulare. Nel cuore, questo fenomeno risulterebbe protettivo della funzione contrattile.Se confermata, l’ipotesi fondante di questa ricerca aprirebbe l’orizzonte a nuove opportunità di intervento per la protezione cardiaca e di altri organi (polmone, rene) dal danno da radiazioni ionizzanti, con implicazioni vaste in varie attività umane (terapia dei tumori, ricerca aereospaziale, fisica delle particelle).Metodi:Iniezione intracardiaca ed irraggiamentoI topi che utilizzerremo sono incrociati nel background genetico dei C57/Bl6, un ceppo che ha dimostrato la migliore tolleranza al modello sperimentale che intendiamo applicare. Topi GRK2 flox/flox aventi le sequenze flox a monte e a valle del gene di GRK2 saranno incrociati con topi con overespressione selettiva cardiaca di dell’enzima batterico CRE recombinasi, per la generazione di animali con delezione selettiva cardiaca di GRK2. Tali animali e i loro negative littermate, così come topi wild type C57/bl6 saranno sottoposti ad iniezione intracardiaca per la somministrazione selettiva nel cuore di un peptide inbitore di GRK2. La procedura verrà eseguità mediante tecnica di esposizione del cuore tipo “pop-up”. Dopo 7 giorni dall’iniezione gli animali saranno sottoposti ad irradiatore a raggi X (RS 2000 RAD SOURCE, Medical Service, Pordenone, Italia). Dopo l’esposizione a raggi X, gli animali saranno mantenuti in gabbie isolate e a respirazione controllata e a 3 e ad 8 ore sarà effettuato Ecocardiografia per valutare la frazione di eiezione o cateterismo cardiaco per la misurazione della pressione intraventricolare per la valutazione della funzione contrattile.Qui di seguito sono elencati i gruppi di studio suddivisi in base al trattamento:•Inibitore peptidico•Inibitore small molecule•PlaceboEsami ex vivoSu campioni di cuore verranno effettuati una serie di accertamenti biochimici, istologici, fisiologici e metabolici, finalizzati alla comprensione dei meccanismi di adattamento neuroormonale alla irradiazione e alla identificazione dei bersagli terapeutici. Produrremo inoltre miocardiociti isolati a partenza dal cuore isolato e perfuso.Valutazione del Signaling adrenergico:L’integrità del signaling adrenergico verrà valutata mediante l’analisi della densità recettoriale beta adrenergica, la capacità di produrre cAMP in risposta ad agonisti, e alla espressione e attività delle GRK (responsabili della desensibilizzazione)Traffiking subcellulare di GRK2.Essendo nota la capacità della chinasi di localizzare all’interno dei mitocondri, valuteremo gli effetti della irradiazione sull’accumulo mitocondriale di GRK2 nel mitocondrio, mediante western blot su frazioni mitocondriali o immunofluorescenza alla microscopia conficale. Effetti dell’irradiazione sulla struttura cardiaca e densità mitocondrialeMediante analisi istologica, immuno fluorescente e di microscopia elettronica valuteremo gli effetti della irradiazione sulla struttura e densità mitocondriale in sezioni cardiacheValutazione della funzione mitocondriale.La funzione mitocondriale verrà valutata su estratti cardiaci arricchiti o meno di frazione mitocondriale mediante centrifugazioni sequenziali. Su tali estratti valuteremo la massa mitocondriale, il contenuto in DNA e RNA mitocondriale, la produzione di ATP, SU miocardiociti isolati mediante tecnologia Langendhorf, valuteremo il consumo di ossigeno basale (OCR) e l'acidificazione extracellulare (ECAR). Questa serie di esperimenti verranno effettuati in service utilizzando la tecnologia SeaHorse.