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RUOLO DELL'IMMUNITÀ ADATTATIVA E DEL METABOLISMO NELLA PATOGENESI DELLE SINDROMI AUTOINFIAMMATORIE

Dal sangue periferico di pazienti affetti da TRAPS e da controlli sani, dopo ottenimento del consenso informato, effettueremo:- Isolamento i PBMC (peripheral blood mononuclear cells) dal sangue periferico mediante centrifugazione con Ficoll in gradiende di densità. - Analisi della percentuale e dei pricipali marker di superficie delle cellule Treg mediante FACS analisi– Isolamento mediante il Dynal CD4+CD25+ Treg kit, di CD4+CD25+ (Treg) e le CD4+CD25- (Teff) a partire dai PBMC, mediante selezione positiva e negativa sfruttando la presenza di antigeni di superficie. - Saggi di proliferazione in vitro con e senza stimolo proliferativo (stimolazione del TCR mediante anticorpi anti CD3 ed anti CD28) per valutare il potenziale proliferativo delle cellule (PBMCs, CD4+CD25+ (Treg), CD4+CD25- (Teff) ) di pazienti TRAPS (alla diagnosi e dopo trattamento) confrontandolo con quelle di controlli sani e dosaggio mediante saggio immunoenzimatico delle principali citochine pro ed anti infiammatorie nei surnatanti dei suddetti pazienti. - Saggi di proliferazione in vitro in siero autologo e siero eterologo per identificare fattori solubili nel siero di pazienti TRAPS che possono alterare la proliferazione cellulare.- Valutazione del potenziale soppressorio delle cellule CD4+CD25+ quando messe in co-cultura con cellule T CD4+CD25- (T effettrici) in rapporto 1:1, in quanto la capacità soppressoria delle Treg rappresenta una delle principali caratteristiche fenotipiche di tali cellule.- Immunofentotipo completo delle diverse sottopopolazioni linfocitarie (CD3, CD4, CD8, CD20, CD16/CD32, CD4CD25, CD425+, CD4DR, CD4CD45RA, CD4CD45RO, CD8DR, CD8CD45RA, CD8CD45RO) - Dosaggio di citochine (Th1, Th2, Th17) ed adipochine (leptina, LepR, resistina, CD40L, osteoprotegerina), mediante saggio immunoenzimatico, sul siero di soggetti affetti da Traps e controlli sani- Valutazione dei livelli di espressione del FoxP3, fattore di trascrizione appartenente alla famiglia forkhead, fondamentale lo sviluppo e la funzione delle Treg, e di tutte le sue isoforme mediante western blot- Valutazione del funzionamento della via di seganalazione IL-2-IL-2R (fosfo-STAT5), in quanto quest’ultima ha un ruolo centrale nella generazione, omeaostasi e proliferazione in vivo delle cellule Treg.- Analisi dei principali pathways biochimici coinvolti nell’attivazione di tali cellule (TCR, FoxP3, Leptina) mediante Western blot e PCR - Misurazione dinamica ex vivo mediante analizzatore del flusso metabolico extracellulare (Seahorse) delle principali vie metaboliche cellulari (glicolisi, ossidazione lipidica e respirazione mitocondriale)