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RUOLO DEI PIWI-INTERACTING RNA NELLA CARCINOGENESI E DEFINIZIONE DEL FENOTIPO TUMORALE

La ricerca si articolerà in quattro fasi, secondo il seguente piano di lavoro: 1. Inizialmente, per ciascun modello sperimentale, verrà valutata la presenza e l’abbondanza relativa delle proteine PIWIL e dei fattori coinvolti nella biogenesi dei piRNA attraverso analisi di real-time QPCR, SDS-Page e Western Blotting; successivamente, verranno impiegate tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per caratterizzare il trascrittoma di queste linee cellulari ed ottenere un profilo globale dell’espressione dei piccoli RNA non codificanti. Allo scopo, verranno generate librerie di cDNA utilizzando sia un protocollo per RNA totale che per piccoli RNA; le stesse verranno poi sequenziate su piattaforma Illumina e i dati ottenuti verranno analizzati con la pipeline modulare iMir (Giurato et al., 2013); l’approccio utilizzato permetterà di identificare la presenza dei piRNA ma anche di altri piccoli RNA non codificanti (miRNA, snoRNA, tRNA ecc..). 2. Arricchimento selettivo della frazione dei piRNA; a questo scopo verranno applicate metodiche sperimentali come RNA-immunoprecipitation (RIP-Seq) e cross-linking immunoprecipitation (CLIP-Seq), approcci basati sull’utilizzo di anticorpi che permettono di immunoprecipitare le proteine PIWIL ed identificare gli RNA ad esse associati; questo permetterà sia di arricchire il campione di partenza che di isolare i piRNA attraverso la loro specifica associazione con le diverse proteine PIWIL. Inoltre, i dati ottenuti verranno analizzati applicando metodi di predizione bioinformatici per identificare nuovi piRNA putativi non ancora annotati. 3. I profili di espressione di questi piccoli RNA verranno analizzati con metodologie bioinformatiche allo scopo di identificare piRNA che mostrano una espressione differenziale tra le diverse linee cellulari, correlandoli con quelli già identificati nei tessuti tumorali in diversi stadi della patologia (Martinez et al, 2015) e con le caratteristiche genetiche del tumore dipartenza; inoltre, verrà effettuata una ricerca “in silico” degli RNA bersaglio dei piRNA identificati, mediante l’applicazione di metodi basati sulla complementarietà di sequenza che permettono di effettuare una predizione delle interazioni RNA-RNA utilizzando i trascrittomi ottenuti per i modelli cellulari scelti. L’identificazione di un profilo di piRNA e dei loro bersagli in linee cellulari diverse potrà essere il punto di partenza per la messa a punto di nuovi biomarcatori per la tipizzazione molecolare e la stadiazione clinica di una patologia. 4.Successivamente verrà affrontato lo studio di funzione: allo scopo di comprendere il coinvolgimento dei piRNA nella trasformazione tumorale ed in altri eventi di natura patologica verranno confermate sperimentalmente le predizioni in silico effettuate; per fare questo verranno avviati studi di over-espressione, mediante l’utilizzo di oligonucleotidi che mimano la funzione dei piRNA, e di silenziamento, con l’impiego di nucleotidi antisenso che bloccano la funzione dei piRNA maturi. Parallelamente, sulle linee cellulari saranno testati diversi metodi di trasfezione per ottenere una espressione stabile o transiente dei geni codificanti per le proteine PIWIL ed analizzarne i trascrittomi. BIBLIOGRAFIA: - Giurato G, et al. BMC Bioinformatics 14:362, 2013. - Hashim A, et al. Oncotarget 5(20):9901-10, 2014. - Martinez VD, et al. Sci. Rep. 5:10423, 2015. - Medico E, et al. Nat. Commun. 6:7002, 2015. - Oh SJ, et al. Korean J. Pathol. 46(4):318-23, 2012. - Zhai L, et al. Int. J. Mol. Sci.17(2), 2016.