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ETEROGENEITÀ INTRATUMORALE DI BRAF MUTATO NEL CARCINOMA TIROIDEO

Da esperimenti preliminari è risultato che BRAFV600E viene espresso in cellule con BRAF wild-type co-coltivate con cellule tumorali portatrici della mutazione. Caratterizzeremo questo fenomeno. Il progetto prevede le seguenti azioni: Azione 1: Preparazione delle cellule. Cellule di PTC BCPAP (BRAFV600E positive) e PTC1 (RET/PTC1 positive) verranno messe in coltura. Le cellule PTC1 verranno coltivate in mezzo contenente bromo-deossi-uridina (BrU) che verrà incorporata nei nuclei durante la fase di sintesi del DNA. In tale modo le cellule PTC1 potranno agevolmente essere identificate attraverso la colorazione con un anticorpo anti-BrU. Le cellule BCPAP e PTC1 verranno colorate con immunofluorescenza indiretta con l’anticorpo VE1 che riconosce in modo specifico BRAFV600E e analizzate con microscopio confocale e verrà eseguito Western blot con lo stesso anticorpo per identificare la banda specifica. Questi esperimenti consentiranno di mettere a punto le metodiche per identificare BRAFV600E. Azione 2: Esperimenti di co-cultura. BCPAP e PTC1 verranno co-coltivate per tempi variabili in diverse modalità. Una piastra contenente vetrini copri oggetto verrà inseminata con una miscela dei due tipi cellulari e lasciata in coltura fino a 96h. A tempi variabili i vetrini verranno recuperati, fissati ed analizzati per immunofluorescenza secondo quanto stabilito con l’azione 1. Le cellule PTC1 verrano chiaramente distinte dalle BCPAP mediante colorazione con Ab anti BrU e la espressione ectopica di BRAFV600E verrà evidenziata mediante colorazione con l’Ab VE1. Piastre verranno seminate con cellule BCPAP e coltivate fino a 96h. Nelle piastre verranno posti degli inserti porosi per la coltivazione delle PTC1. Queste verranno recuperate, le proteine estratte e analizzate per Western blot con l’Ab VE1. Azione 3: Verifica del trasferimento BCPAP/PTC1 di mRNA e/o proteina BRAFV600E. E’ possibile che il solo mRNA di BRAFV600E o la proteina o entrambi vengano trasferiti dalle cellule BCPAP alle PTC1. Per analizzare questo punto, verrà eseguita una FISH adattata a riconoscere la singola mutazione BRAFA1799T. Questa metodica è stata recentemente messa a punto proprio per questa mutazione ed è risultata in grado di riconoscerla sia nel mRNA che nel DNA cromosomico. Il dato verrà incrociato con l’immunofluorescenza con l’AbVE1 Voci bibliografiche Nikiforov YE. Thyroid cancer in 2015: Molecular landscape of thyroid cancer continues to be deciphered. Nat Rev Endocrinol. 2016 Feb;12(2):67-8 Guerra A, Sapio MR, Marotta V, Campanile E, Rossi S, Forno I, Fugazzola L, Budillon A, Moccia T, Fenzi G, Vitale M. The primary occurrence of BRAF(V600E) is a rare clonal event in papillary thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2012 Feb;97(2):517-24. Guerra A, Fugazzola L, Marotta V, Cirillo M, Rossi S, Cirello V, Forno I, Moccia T, Budillon A, Vitale M. A high percentage of BRAFV600E alleles in papillary thyroid carcinoma predicts a poorer outcome. J Clin Endocrinol Metab. 2012 Jul;97(7):2333-40. Ghossein RA, Katabi N, Fagin JA. Immunohistochemical detection of mutated BRAF V600E supports the clonal origin of BRAF-induced thyroid cancers along the spectrum of disease progression. J Clin Endocrinol Metab. 2013 Aug;98(8):E1414-21 de Biase D, Cesari V, Visani M, Casadei GP, Cremonini N, Gandolfi G, Sancisi V, Ragazzi M, Pession A, Ciarrocchi A, Tallini G. High-sensitivity BRAF mutation analysis: BRAF V600E is acquired early during tumor development but is heterogeneously distributed in a subset of papillary thyroid carcinomas. J Clin Endocrinol Metab. 2014 Aug;99(8):E1530-8. Ginart P, Kalish JM, Jiang CL, Yu AC, Bartolomei MS, Raj A. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 2016 Mar 1;30(5):567-78.