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IL SISTEMA UROCHINASI/RECETTORE DELL'UROCHINASI IN CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE NORMALI E TUMORALI: EFFETTI DELL'INIBIZIONE DELL'INTERAZIONE CON I RECETTORI PER L'FMLF.

Scopo del progetto è lo studio del ruolo esercitato dall'interazione dell'uPAR solubile (suPAR) con gli FPRs nel “trafficking”, proliferazione e differenziamento di cellule di AML. In tale cellule saranno studiati gli effetti biologici dell’attivazione degli FPRs mediata dalle varie forme di uPAR solubile, le vie di segnale intracellulare attivate e la capacità di modulare l’attività di recettori integrinici e di altri recettori di chemotassi. Data l’aumentata espressione di uPAR, sia sulla membrana di cellule di AML che, in forma solubile, nel plasma di soggetti malati, saranno poi testate due piccole molecole, identificate mediante SB-VS e in grado di inibire il legame dell'uPAR agli FPRs, per i loro effetti sulla diffusione e crescita leucemica in vitro e in vivo.Gli obiettivi specifici di questo progetto sono:1) definire il ruolo dell’interazione delle due diverse forme di uPAR solubile con gli FPRs nell’adesione, migrazione, proliferazione e sopravvivenza di cellule di AML umane.A tale scopo, l’espressione di FPR1, FPR2, e FPR3 sarà valutata, mediante RT-PCR e analisi citofluorimetrica, su cellule di linee di AML a vari gradi di differenziamento (KG1, HL-60, NB4, U937, THP1) e poi su blasti provenienti da soggetti affetti da LMA, dopo consenso informato. Tale indagine permetterà di evidenziare un’eventuale modulazione dei livelli di espressione dei vari FPR in cellule di LMA rispetto alle HSCs normali, ed anche eventuali cambiamenti nel loro profilo di espressione nel corso del differenziamento emopoietico.Poi, cellule di LMA, sia di linea che primarie, saranno sottoposte a saggi di adesione in vitro, di migrazione in camere di Boyden, di proliferazione (mediante MTT e incorporazione di 3H-timidina) e di apoptosi (mediante citometria a flusso dopo marcatura con ioduro di propidio e Western blot con anticorpi anti-caspasi 3), dopo stimolazione con agonisti specifici dei diversi FPR (fMLF, peptide WKYKVm), con suPAR, e con uPAR84-95, un peptide sintetico derivato dell’uPAR e contenente la sequenza SRSRY in grado di legare e attivare gli FPRS, mimando l'azione del DIIDIII-suPAR. Tali indagini permetteranno di studiare gli effetti sul comportamento cellulare dell’interazione con gli FPRs delle due forme di uPAR solubile, entrambe incrementate sia nell'espressione cellulare che plasmatica in pazienti affetti da AML.2) definire le vie di trasduzione del segnale attivate dall’interazione tra l'uPAR solubile e gli FPRs in cellule di AML umane.Linee cellulari e cellule primarie di LMA saranno stimolate con agonisti specifici dei diversi FPRs (fMLF, peptide WKYKVm), con suPAR, e con uPAR84-95. Le cellule saranno poi lisate e analizzate mediante Western blot e co-immunoprecipitazione con anticorpi diretti contro i possibili mediatori del loro segnale intracellulare. Tale analisi potrà evidenziare eventuali anomalie nel segnale generato dall’interazione uPAR/FPRs nelle AML e costituire quindi la base per una terapia mirata verso i trasduttori di segnale attivati, o verso l’interazione stessa.3) studiare in vitro e in vivo gli effetti sulla crescita e diffusione leucemica di piccole molecole solubili inibenti l’interazione dell’uPAR con gli FPRs. Tali molecole individuate in collaborazione con A. Lavecchia, Dipartimento di Farmacia, Università “Federico II, Napoli, sono state poi selezionate in cellule transfettate con uPAR, usando come controllo cellule uPAR-negative. Sono state così ottenute due molecole, i composti 6 e 37, in grado di inibire specificamente l’interazione dell’uPAR con gli FPRs. Verrà valutata la capacità di tali molecole di inibire in vitro l’adesione, la migrazione e la proliferazione di cellule di LMA in linea e primarie. Successivamente, le piccole molecole inibitorie verranno valutate in vivo in topi NOD/SCID xeno-trapiantati con cellule di LMA umane.Piccole molecole inibenti l’uPAR solubile potrebbero costituire un nuovo strumento terapeutico nelle LMA, data la loro elevata specificità e la possibilità di somministrazione per via orale.