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LA LOCALIZZAZIONE SUBCELLULARE DI GRK2 COME NUOVA STRATEGIA TERAPEUTICA NELLA PREVENZIONE DEL DANNO DI ORGANO INDOTTA DA ARTRITE REUMATOIDE ED IPERTENSIONE

Il progetto comprende tre working packages (WP). Nel WP1 valuteremo la disfunzione multiorgano indotta dell’infusione cronica con AngII in animali trangenici con delezione selettiva di GRK2 ell’endotelio o nella linea mieloide. Contemporaneamente in cellule endoteliali “BAEC” e macrofagiche RAW 263 RAW 264.7 indurremo overespressione, silenziamento e compartimentalizzazione di GRK2 mediante pcDNA 3,1-GRK2, siRNA-GRK2 o pcDNA3.1 codificante per la porzione carbossi-terminale di questa chinasi (βARKct). E’ noto che nei RAW 264.7, βARKct riduce il legame di GRK2 con βγ a livello della membrana plasmatica, favorendone la localizzazione mitocondriale. Verranno valutate in risposta alla stimolazione con AngII la secrezione di citochine infiammatorie e l’ espressione delle molecole di adesione. Nel WP2 utilizzeremo Studi biochimici per lo sviluppo di piccoli peptidi da testare “in vitro” e “in vivo”. In particolare, definita la capacità di ßARK-ct di contrastare la disfunzione endoteliale e l’attivazione macrofagica indotta da AngII, piccoli peptidi verranno disegnati e sintetizzati. Il nostro obiettivo è identificare la più piccola regione proteica di ßARKct , in grado di indurre la localizzazione di GRK2 nei mitocondri e riprodurre “in vitro” gli effetti biologici di GRK2. Contemporaneamente, verrà valutato l’interactoma di GRK2 in risposta a stimolazione con AngII. EC e RAW 264.7 stimolate con AngII e frazionate nelle componenti nucleari, citosoliche , mitocondriali e di membrana. Quindi identificazione delle proteine partners di GRK2 e dei siti di interazione. In questo modo identificheremo strategie alternative per indurre compartimentalizzazione di GRK2. Nel WP3 Valuteremo l’efficacia della terapia nel prevenire il danno d’organo in ratti. Saranno utilizzati ratti con artrite indotta da adiuvante (AIA) e ratti spontaneamente ipertesi (SHR). Questi due modelli di malattia, nonostante la diversa eziologia, presentano disfunzione endoteliale e attivazione di risposta immune innata. Questo progetto è innovativo perche’ 1) Modifica l'approccio farmacologico: dall’antagonismo dei recettori di membrana alla modulazione farmacologica di proteine ad elevata complessità. Con questa proposta intendiamo introdurre un nuovo approccio basato sulla modulazione di proteine intracellulari a elevata complessità molecolare. 2) Introduce il concetto di compartimentalizzazione. I nostri studi dimostreranno che è possibile ridurre la progressione della malattie croniche modificando la localizzazione sub-cellulare di molecole ad elevata complessità quale è GRK2. 3) Quando, dove e come modulare GRK2. Il livello di espressione e di attività di GRK2 varia tra le diverse patologie e riflette un specifico complesso di interazioni molecolari. Attraverso l'analisi proteomica e la definizione dell’ interactoma “dinamico”saremo in grado di definire quando una strategia basata su GRK2 può essere utilizzata e come modificare la sua localizzazione subcellulare. Nonostante l’enorme mole di dati e pubblicazioni prodotte negli ultimi 20 anni che dimostrano il ruolo fondamentale di GRK2 nella progressione delle patologie croniche, una terapia basata sulla modulazione di questa molecola non è ancora presente nella pratica clinica. Finora, le strategie basate sull’inibizione dell’attività chinasica di GRK2 hanno prodotto risultati contrastanti dovuti soprattutto alle multiple funzioni cellulari regolate da parte di questa molecola, che rendono difficile un terapia farmacologica basata su un’inibizione generalizzata. Questa proposta di progetto prevede un approccio multidisciplinare in cui l’integrazione di molteplici conoscenze e competenze di biologia molecolare, biochimica, farmacologia e fisiopatologia sono integrate al fine di creare una nuova strategia basata sulla complessità molecolare di GRK2 ed ha quindi l’ambizione di traslare la vasta letteratura scientifica che in questi anni è stata prodotta in campo terapeutico.