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TBX1: REGOLATORE DELLA NEUROGENESI CORTICALE MURINA

Obiettivo1. Determinare le conseguenze patologiche dell’inattivazione di Tbx1 per la neurogenesi corticale precoce. Ipotesi: Tbx1 è necessario nella zone proliferanti della neocarteccia per l’espansione dei progenitori neuronali apicali (AP) e basali (BP). Dati ottenuti nel mio laboratorio e da altri hanno mostrato che in determinati tessuti embrionali, quali il cuore e l’otociste (orecchio primitivo), Tbx1 è importante per l’espansione del pool di cellule progenitori che poi, attraverso il processo di differenziamento cellulare, contribuisce a tessuti embrionali definitivi. Per valutare se questa attività è valida anche nel cervello embrionale proponiamo di valutare la proliferazione e il differenziamento di progenitori neuronali nella corteccia sensoria e motoria embrionale in mutanti Tbx1. Metodi sperimentali Gli esperimenti saranno eseguiti agli stadi embrionali E13.5, E15.5 e E18.5 in embrioni con i seguenti genotipi; Tbx1 eterozigote, Tbx1 omozigote, wild type (WT).La proliferazione cellulare sarà valutata in sezioni istologiche mediante immunofluorescenza (IF) con anticorpi anti-fosfoistone 3 (PH3) e anti-Ki67. Il differenziamento neuronale sarà valutato mediante immunofluorescenza o ibridazione in situ (ISH) con anticorpi e/o sonde a RNA diretti contra le seguenti molecole; Tis21, NeuroD2, Neurogenin, Tbr1 e Tbr2, NeuN. La migrazione degli interneuroni sarà valutata mediante IF con anti-calbindina. Differenze quantitative nell’espressione dei marcatori tra mutanti e controlli saranno determinate misurando i seguenti parametri: dimensione dell’area di espressione (IF e ISH); densità ottica (ISH); conta di cellule marcate (IF). Nel primo periodo, valuteremo la neurogenesi nella neocorteccia che è popolata principlamente da neuroni eccitatori (glutamatergici) e nelle eminence gangioniche dove nascono gli interneuroni inibitori (GABAergici). Obietivo 2. Caratterizzare l’architettura neuronale corticale in mutanti Tbx1 Dati preliminari ottenuti nel mio laboratorio mostrano un’espansione dello strato corticale IV nel mutante Tbx1 eterozigote adulto. Interessante è la descrizione recente di una stratificazione corticale anomala in un neonato affetto dalla 22q11.2DS (Wu, 2014). Proponiamo di caratterizzare in dettaglio la stratificazione neuronale dell’intero spessore corticale in mutanti Tbx1 eterozigoti adulti. E' importante studiare la corteccia adulta non solo per identificare delle alterazioni che coinvolgono gli altri strati corticali ma anche per valutare la persistenza di anomalie neuronali riscontrate negli stadi embrionali precoci che potrebbero aggravarsi o essere risolte per via dell'intervento di meccanismi compensatori. Metodi sperimentali Gli esperimenti saranno eseguiti in Tbx1 eterozigoti adulti e controlli (WT) all’eta di 8-12 settimane utilizzando le metodiche descritte nel Ob. 1. Saranno utilizzati i seguenti marcatori specifici degli strati corticali; VI, (Tbr1); V, (Fezf2); IV, (Rorb);II, III (Cux1).